正交試驗(yàn)法優(yōu)選假蒟中總生物堿的提取工藝

董文燊，譚興起，邵留英，李 清，瞿發(fā)林*，沈夢(mèng)霞

0 引言

假蒟PipersarmentosumRoxb.為胡椒科Piperaceae胡椒屬Piper植物，又名蛤蔞、假蔞、山蔞等，多年生、匍匐、逐節(jié)生根草本，具有溫中散寒、祛風(fēng)利濕、消腫止痛之功效。假蒟是一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，主要產(chǎn)于中國(guó)廣東、廣西、福建、云南、貴州及西藏(墨脫)各省區(qū)，生于林下或村旁濕地上，一年四季均可采收。其所含的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、木脂素、有機(jī)酸、生物堿等。目前已報(bào)道的關(guān)于假蒟藥理作用的研究主要是抑菌、殺蟲、抗炎、解熱、抗氧化等方面[1-2]。

近年來，同屬胡椒屬的其他植物，如大葉蒟PiperlaetispicumC.DC和光軸苧葉蒟Piperboehmeriaefolium(Miq.) C.DC.var.tonkinense.C.DC.相繼被報(bào)道具有抗抑郁活性。根據(jù)同屬近源的關(guān)系，本課題組前期對(duì)假蒟的抗抑郁活性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，其具有明顯的抗抑郁作用[3]。大葉蒟和光軸苧葉蒟中抗抑郁活性成分為酰胺類生物堿[4-5]，提示假蒟中抗抑郁活性成分也可能是此類化合物，而胡椒堿為假蒟中酰胺類生物堿代表性成分，也是目前較易獲得的化合物，并且有研究表明，胡椒堿具有抗抑郁藥理作用[6-8]。因此，本文以胡椒堿為對(duì)照，采用酸性染色比色法[9-10]，以總生物堿及浸膏量為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選提取假蒟的最佳工藝，為假蒟的進(jìn)一步開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，752N紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，XS105型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，EI-300J型電子天平(常州市天之平儀器設(shè)備有限公司)，RE-5C式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)，YB-IA型真空恒溫干燥箱(天津市金洲科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 假蒟(采集于廣東省陽(yáng)春市永寧鎮(zhèn)，批號(hào)：20171220，經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○四醫(yī)院瞿發(fā)林主任藥師鑒定為胡椒科假蒟的莖、葉)；胡椒堿對(duì)照品(含量以98.9%計(jì)，批號(hào)：110775-201706，中國(guó)食品藥品檢定研究院，規(guī)格20 mg)；甲醇(色譜醇)；乙醇、鹽酸、醋酸、醋酸鈉、氨水、二氯甲烷、無水硫酸鈉、溴甲酚綠(均為分析純)；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 溴甲酚綠緩沖液的制備 取溴甲酚綠0.1 g，加醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)10 ml使溶解，再加醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)稀釋至100 ml，即得。

2.1.2 溶液的制備 ①供試品溶液的制備：稱取假蒟提取物1 g，用0.5 mol/L的鹽酸溶液20 ml，超聲溶解，過濾，濾液用氨水調(diào)pH為9～10，加入等量的二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷層，濃縮并定容至25 ml量瓶中，取5.0 ml轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入5 ml溴甲酚綠緩沖液和15 ml二氯甲烷，順時(shí)針振搖1 min，靜置1 h，分取二氯甲烷層并用無水硫酸鈉進(jìn)行脫水，將二氯甲烷作為供試品溶液。②對(duì)照品溶液的制備：精密稱取胡椒堿對(duì)照品17.42 mg，置50 ml量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 ml、加溴甲酚綠緩沖液5 ml和二氯甲烷20 ml置于分液漏斗中，同法制作對(duì)照品溶液。③空白對(duì)照溶液的制備：取5 ml溴甲酚綠緩沖液和20 ml二氯甲烷同法制作空白對(duì)照溶液。

2.1.3 專屬性試驗(yàn) 對(duì)空白對(duì)照溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(200～800 nm)，并進(jìn)行基線校正，然后對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，選取最大吸收波長(zhǎng)415 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。見圖1。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 制成含胡椒堿251.21、276.33、301.45、326.57、351.69和376.82 μg/ml的對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，在415 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，以胡椒堿量為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.004 2x-0.818 5，r=0.999 3，線性范圍為251.21～376.82 μg/ml。

圖1 紫外可見光掃描圖

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，在415 nm波長(zhǎng)連續(xù)測(cè)定5次吸光度，所測(cè)得吸光度的RSD為0.25%，表明精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一份供試品溶液，每隔30 min測(cè)1次吸光度，供試品溶液在4 h內(nèi)吸光度的RSD為1.48%，結(jié)果表明，供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批假蒟提取物適量，共5份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，同法測(cè)定。結(jié)果假蒟提取物中平均吸光度為0.536，RSD為1.16%。

2.1.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的假蒟提取物6份，分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液(胡椒堿348.4 μg/ml)0.5 ml，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，同法測(cè)定。結(jié)果平均回收率為100.23%，RSD為1.29%。見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 浸膏得率的測(cè)定

2.2.1 蒸發(fā)皿的預(yù)處理 蒸發(fā)皿105 ℃烘5 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W1，繼續(xù)烘1 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W2，當(dāng)W1與W2之差絕對(duì)值≤0.3 mg，置干燥器備用。

2.2.2 浸膏量的測(cè)定 假蒟藥材提取液60 ℃減壓濃縮至稠膏狀，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，60 ℃減壓干燥5 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W3，繼續(xù)干燥1 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W4，直到W3與W4之差絕對(duì)值≤0.3 mg。浸膏量：W4-W2。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 提取方法 將假蒟的干燥莖和葉，切段成直經(jīng)為0.5～1.5 cm，稱取80 g于三頸圓底燒瓶中，按照煎煮因素水平回流提取(煎煮前先將藥材浸泡1 h)，提取液用紗布?jí)赫V過，得假蒟藥材提取液。

2.3.2 正交試驗(yàn) 選擇乙醇用量、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為參考因素，以假蒟提取物重量和總生物堿含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用L9(34)正交試驗(yàn)表對(duì)以上4個(gè)因素進(jìn)行考察，見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

2.3.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表3、表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

注：總藥材假蒟為80 g

表4 方差分析

從表2、表3結(jié)果可以看出：4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為B>D>C>A，依次為乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間和乙醇用量。因素B的F=149.671 3，P<0.01，因素D的F=142.231 9，P<0.01，因素B、D均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明乙醇濃度(B)和提取次數(shù)(D)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有極顯著性影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝應(yīng)為A2B2C1D3，即10倍量的80%乙醇，回流提取3次，每次1 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳提取工藝，制備5批樣品，測(cè)定假蒟提取物重量和總生物堿含量，進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

從表5結(jié)果可知，重復(fù)優(yōu)選工藝條件中假蒟提取物的重量為14.53～15.42 g，總生物堿的含量為99.64～105.00 mg，兩者的綜合評(píng)分值在0.95～1.00，表明該工藝方法穩(wěn)定；平行試驗(yàn)的2個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的RSD均小于2.4%，表明該方法重現(xiàn)性好，可為假蒟的進(jìn)一步開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 討論

目前，對(duì)假蒟藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究主要集中在α-細(xì)辛腦這一成分上，本試驗(yàn)需對(duì)藥材進(jìn)行煎煮、濃縮、干燥等加熱環(huán)節(jié)，而α-細(xì)辛腦屬揮發(fā)油類，不適于假蒟藥材提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)。也有文獻(xiàn)報(bào)道，以鹽酸小檗堿為對(duì)照，采用酸性染色比色法，對(duì)假蒟不同部位(根、莖、葉)總生物堿進(jìn)行含量測(cè)定[11]。本課題組主要研究目的為假蒟抗抑郁作用，而胡椒堿為假蒟中酰胺類生物堿代表性成分，也是目前較易獲得的化合物。現(xiàn)代研究表明，胡椒堿可通過調(diào)節(jié)單胺氧化酶發(fā)揮抗抑郁的藥理作用[6-8]。因此，本文以胡椒堿為對(duì)照，評(píng)價(jià)假蒟中總生物堿的提取工藝，其專屬性強(qiáng)，更具有研究意義。 在預(yù)試驗(yàn)中曾采用高效液相色譜法測(cè)定假蒟藥材提取物中胡椒堿含量，但含量極少。因此，本試驗(yàn)采用酸性染色比色法測(cè)定總生物堿含量，而其含量的高低與穩(wěn)定易受酸性染料的種類、用量及pH值的影響。因此，本方法考察了溴麝香草酚藍(lán)、溴甲酚綠和溴酚藍(lán)3種酸性染料對(duì)胡椒堿的絡(luò)合作用，結(jié)果溴甲酚綠染料絡(luò)合反應(yīng)效果最好。同時(shí)，對(duì)溴甲酚綠緩沖液用量(1、3、5、7、9 ml)和pH(pH 3.5～5.5)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，當(dāng)緩沖液用量達(dá)到5 ml時(shí)，既能達(dá)到絡(luò)合反應(yīng)完全，且緩沖液pH 4.5時(shí)，絡(luò)合反應(yīng)溶液的吸光度最穩(wěn)定，最終選擇5 ml溴甲酚綠緩沖液(pH 4.5)作為反應(yīng)介質(zhì)系統(tǒng)。

正交試驗(yàn)結(jié)果采用假蒟藥材提取浸膏量及總生物堿含量2個(gè)指標(biāo)，因此以加權(quán)評(píng)分的方法計(jì)算綜合評(píng)分，根據(jù)2個(gè)指標(biāo)的重要程度，將假蒟提取浸膏量和總生物堿含量的權(quán)重系數(shù)分別定為0.3和0.7，二者的綜合評(píng)分為[(浸膏重量/max浸膏重量×0.3)+(總生物堿含量/max總生物堿含量×0.7)]。

以胡椒堿為對(duì)照，優(yōu)選假蒟中總生物堿的提取工藝尚未見報(bào)道，本文采用酸性染色比色法，以假蒟提取物重量及總生物堿為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)法優(yōu)選出了假蒟的最佳提取工藝，經(jīng)過5批藥材最佳提取工藝驗(yàn)證，結(jié)果表明，該提取工藝簡(jiǎn)單、可行、穩(wěn)定，為假蒟的開發(fā)與使用提供了一定的理論依據(jù)。