核因子E2相關因子2在足月胎膜早破組織中的表達及臨床意義

劉佳佳，于駿，謝冰，方杰，欒曉瑾，顏一丹

（1.江蘇大學附屬醫院婦產科，江蘇鎮江212001；2.江蘇大學附屬第四人民醫院婦產科，江蘇鎮江212001）

胎膜早破指的是胎膜在臨產前的破裂［1］，常伴隨多種并發癥，如絨毛膜羊膜炎、早產、腦癱等，早期精準診斷是有效管理和預防并發癥的關鍵［2］。胎膜早破可由多因素引起，包括感染、吸煙、雙胎妊娠等［3-4］；炎癥—氧化應激在造成胎膜損害的過程中起重要作用［4］。研究表明，局灶性感染和炎癥可能在胎膜早破的發病機制中起主要作用［5-6］。破膜部位的炎癥改變表明細菌感染可能是胎膜早破的啟動者［6-7］。核因子 E2相關因子2（nuclear erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一種重要的抗炎介質，限制炎癥反應［8］。Nrf2通過抑制促炎細胞因子（如TNF-α和IL-6）以及誘導型一氧化氮合酶的表達發揮抗炎作用，但其在胎膜早破中的作用尚不完全清楚。本研究對胎膜早破患者胎膜組織中Nrf2表達水平進行檢測，分析其與胎膜早破的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 研究對象選擇 本項研究經江蘇大學附屬醫院生物醫學倫理委員會批準實施，患者均知情同意。選取在2016年9月至2017年1月入住我院婦產科的30例健康孕婦（對照組）和30例胎膜早破孕婦（胎膜早破組）。其中，對照組平均年齡（26.43±2.67）歲，平均孕周（39.41±0.29）周；胎膜早破組平均年齡（27.47±2.79）歲，平均孕周（39.40±0.28）周；兩組年齡和孕周間差異均無統計學意義（P均＞0.05），具有可比性。

1.1.2 診斷標準 胎膜早破的診斷依據中華醫學會婦產科學分會產科學組制定的胎膜早破的診斷與處理指南（2015）［9］，在臨產前，產婦會感覺有大量陰道流液，有時可見胎脂或胎糞，進行專科檢查時可能會有多量的液體自宮頸口流出，陰道pH≥6.5，將陰道液涂于玻璃片上自然干燥，在顯微鏡下可觀察到羊齒狀結晶。

1.1.3 納入及排除標準 納入標準：均為第一次妊娠且足月，妊娠期在39周～39+6周之間，未臨產，單胎，胎位為頭位；排除標準：合并糖尿病、高血壓、甲狀腺疾病、急性闌尾炎等內外科疾病，胎兒窘迫或胎死宮內、前置胎盤等胎兒及胎兒附屬物異常。

1.2 胎膜組織及主要試劑

胎盤胎膜娩出后，取胎膜破口處約4 cm×4 cm胎膜組織，生理鹽水沖洗表面血跡，將其均勻分成3份，其中2份置于凍存管放入液氮罐中備用，分別用于熒光定量PCR、蛋白質印跡法；另1份立即行甲醛溶液固定，送至江蘇大學附屬醫院病理科，石蠟包埋制成蠟塊，制作成5μm切片，用于免疫組織化學檢測。

引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。內參β-肌動蛋白引物序列：上游5′-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3′，下游5′-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3′；Nrf2引物序列：上游5′-TGAGGTTTCTTCGGCTACGTT-3′，下游5′-CTTCTGTCAGTTTGGCTTCTGG-3′。

RNA提取液和BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；反轉錄試劑盒（美國Thermo公司）；熒光定量PCR試劑盒（上海Roche公司）；多克隆山羊抗人Nrf2抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司）；多克隆兔抗人Nrf2抗體（英國Abcam公司）；SP試劑盒（北京中杉金橋生物公司）。

1.3 熒光定量PCR檢測胎膜組織Nrf2 mRNA表達

按RNA提取液說明書提取胎膜組織總RNA，核酸測定儀測定各樣本RNA濃度，配制RNA終濃度為200 ng/μL；按說明書將各樣本總RNA反轉錄為cDNA，反應體系10μL，反應條件：42℃ 60 min；70℃ 5 min。

PCR操作方法按照說明書進行，反應體系25μL，2×濃度的反應混合液12.5μL，7.5μmol/L上游引物和下游引物各1μL，cDNA 2.5μL，雙蒸水8μL。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火60 s；40個循環。以β-肌動蛋白作為內參，采用相對定量方法進行分析，公式2-ΔΔCt計算 Nrf2 mRNA相對表達量。

1.4 蛋白質印跡法檢測胎膜組織Nrf2蛋白表達

參考文獻［10］，提取胎膜總蛋白，測定總蛋白濃度；水浴變性；制備分離膠、濃縮膠，SDS-PAGE分離蛋白；濕轉法300 mA恒流30 min將蛋白轉至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；分別加1∶1 000稀釋的多克隆山羊抗人Nrf2抗體和內參β-肌動蛋白，4℃孵育過夜；1×TBST洗膜3次；加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育30 min；1×TBST洗膜3次；發光劑熒光顯色，成像系統顯影；使用PhotoShop和Alpha軟件分析目標帶的光密度值，并統計分析。

1.5 免疫組織化學法檢測胎膜組織Nrf2的定位及表達

采用SP免疫組織化學法，其中陰性對照采用PBS代替一抗。一抗多克隆兔抗人Nrf2抗體稀釋度1∶200，按SP試劑盒說明書操作。二甲苯脫蠟；枸櫞酸鹽緩沖液煮沸行抗原修復；3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶；山羊血清封閉液室溫孵育15 min；分別加入多克隆兔抗人Nrf2抗體和PBS，4℃孵育過夜；1∶200稀釋的羊抗兔IgG室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍片。

SP染色法陽性表達呈棕黃色或棕褐色顆粒，陰性對照中無著色。參考文獻［11］免疫組織化學反應評分的標準，染色強度：0分為無著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；染色細胞百分數：0分為＜1%，1分為1%～10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%。染色強度和染色細胞二者評分相乘計為總得分。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，數據符合正態分布，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 胎膜組織中Nrf2 mRNA和蛋白的表達

胎膜早破組胎膜組織中Nrf2 mRNA和蛋白表達明顯低于對照組（t分別為-9.42，3.79，P＜0.01或P＜0.05），見圖1。

圖1 Nrf2 mRNA和蛋白在兩組胎膜組織中的表達

2.2 胎膜組織中Nrf2的定位及表達量

Nrf2在胎膜組織各層結構的細胞核和細胞質中均可見，其中，Nrf2在羊膜上皮層表達最高。與對照組相比，胎膜早破組的Nrf2在羊膜上皮層、絨毛滋養細胞層和蛻膜層中表達明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2和表1。

3 討論

Nrf2對于炎癥的調節必不可少，在減輕炎癥中發揮重要作用［12-13］。Nrf2抗炎作用與其抑制促炎因子等相關［14］。研究發現，在穩態狀態下，Nrf2在胞質內發揮作用后經蛋白酶體降解；在應激狀態下，Keap1與Nrf2分離，轉移到細胞核并激活細胞保護基因［15］。本研究結果顯示，Nrf2在胎膜組織各層結構的細胞核和細胞質中均可見，與Deshmukh等［15］研究結果基本一致，提示在胎膜組織各層結構的細胞中，穩態及應激狀態共存。由此推測，胎膜早破的發生可能由于穩態與應激狀態失衡。

圖2 光鏡下Nrf2在胎膜組織中的定位及表達

表1 兩組胎膜各層組織結構的Nrf2免疫組化評分±s，分

表1 兩組胎膜各層組織結構的Nrf2免疫組化評分±s，分

組別 羊膜上皮層 結締組織層 絨毛滋養細胞層 蛻膜層 F值 P值.06 ＜0.01胎膜早破組 7.20±1.10 4.00±1.41 6.40±0.89 6.00±1.41 6.18 ＜0.01 t值對照組 11.40±1.34 6.00±2.12 10.20±1.64 9.60±2.51 7 5.42 1.75 4.54 2.79 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.05

Lim等［16］研究發現Nrf2在人胎膜中具有抗炎作用。本研究結果示胎膜早破組孕婦胎膜組織中Nrf2 mRNA和蛋白表達明顯降低，可能致其抗炎功能減弱，從而造成胎膜早破發生。本組健康孕婦和胎膜早破孕婦的胎膜組織中，羊膜上皮層Nrf2表達量均最高。已有研究表明，在炎癥刺激時，羊膜上皮層細胞因子表達水平明顯高于絨毛滋養細胞層和蛻膜層，可能與羊膜上皮層的組織特異性有關［17］。由此表明，Nrf2在羊膜上皮層的高表達可能在胎膜早破中發病中起著至關作用。

綜上，Nrf2在胎膜組織中的表達水平降低可能與胎膜早破的發生發展有關。但并未對Nrf2如何影響胎膜早破具體機制進行深入探討，后期將進一步研究其中的關鍵分子及信號通路，以闡明其在胎膜早破發生發展中的作用。