血漿lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1表達對非小細胞肺癌的診斷價值

王寧新，陳萍*，李堅，呂夢佳，汪毅

（江蘇大學附屬醫院1.呼吸內科，2.中心實驗室，江蘇鎮江212001）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的5年生存率不足20%［1］。及時發現并干預肺癌病灶，有助于降低肺癌患者死亡率，延長生存期。因此探尋高敏感性、高特異性的診斷NSCLC的生物標志物依舊是肺癌防治領域研究的重點和熱點。近年來長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為一種參與癌癥生物學的遺傳分子備受關注。多種lncRNA在腫瘤組織中異常表達，參與腫瘤的發展過程［2］。已有研究表明，肺癌組織中lncRNA生長停滯特異性轉錄本5（growth arrest-specific transcript5，GAS5）的表達低于正常肺組織［3］，而lncRNA-CCAT1的表達則高于正常肺組織［4］。然而，關于這兩類lncRNA在血漿中的表達水平研究較少。本研究選取了NSCLC及良性肺病患者各60例作為研究對象，通過實時熒光定量PCR檢測血漿lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1的表達水平，分析其與相關臨床病理參數的關系，探討其用于診斷NSCLC的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年9月至2018年6月本院呼吸內科住院NSCLC患者60例作為NSCLC組，其中男39例，女21例，年齡38～78歲；病理組織分型：肺腺癌39例，肺鱗癌21例。根據2017年國際抗癌聯盟（UICC）肺癌TNM分期（第8版）標準，該組臨床分期Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期46例，另有10例臨床分期不能明確。NSCLC入選標準：①均經病理組織學或細胞學確診；②均為新發病例，排除肺部轉移性腫瘤者，均未接受過手術、放療、化療或靶向治療。選取同期肺部良性疾病患者60例作為良性肺病組，其中男46例，女14例，年齡25～81歲，病種包括肺炎26例，慢性阻塞性肺疾病19例，支氣管擴張15例。

為評價試驗結果的穩定性，另外選取20例健康人用于血漿lncRNA檢測結果的校對。本研究符合人體試驗倫理學標準，并得到醫院倫理委員會批準，所有受試者在收取標本前均已閱讀并簽署知情同意書。

1.2 試劑及相關儀器

分離血漿RNA時使用美國Thermo SL 16R水平冷凍離心機、美國Thermo MICRO 21R高速冷凍離心機。血漿總RNA提取試劑為Trizol?Reagent（美國Invitrogen公司）。反轉錄合成cDNA時使用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒（大連寶生物公司）、美國Bio-Rad Mycycler PCR儀。實時熒光定量PCR使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒（大連寶生物公司）、美國Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀。

1.3 血漿標本的收集與處理

用無菌針管抽吸受試者全血4 mL，置于乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝試管中，TDL-S臺式低速離心機內3 000 r/min離心10 min，提取血漿400μL，用1.5mL無RNA酶的EP管進行分裝，長期凍存于超低溫冰箱（-80℃）。同時采集每位受試者2 mL的血液標本送核醫學科檢測癌胚抗原及Cyfra21-1（試劑盒說明書標明的癌胚抗原和Cyfra21-1正常上限分別為5μg/L和7μg/L）。

1.4 血漿RNA的提取及cDNA的合成

400μL血漿標本冰面融化后，嚴格按照RNA提取試劑盒說明書提取血漿總RNA，濃度及純度使用U-2800紫外分光光度儀測定，收集的血漿總RNA可置于-80℃長期保存。取固定體積的血漿總RNA，按照反轉錄試劑盒操作說明書反轉錄成cDNA，合成的cDNA置于-20℃長期保存或者立即用于后續實時熒光定量PCR檢測。

1.5 實時熒光定量PCR檢測lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1的表達

取2μL cDNA作為模板，按照 TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒步驟配制熒光定量PCR反應體系，最后在Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀上檢測lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1的表達水平。反應條件：95℃預變性30 s，隨后95℃ 5 s，60℃5 s，共40個循環。每個樣本的每個檢測基因均設置3個復孔，并根據熔解曲線判斷是否為特異性產物。選用GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算兩類lncRNA的相對表達量。使用的引物序列：

GAPDH上游引物為5′-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3′，下游引物為5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′；lncRNA-GAS5上游引物為5′-AGCAAGCCTAACTCAAGCCATTGG-3′，下游引物為5′-ATTAAGCTGGTCCAGGCAAGTTGG-3′；lncRNA-CCAT1上游引物為5′-TGCTCACCTTACTGCCTGAGC-3′，下游引物為5′-GGAGCGCACAACCTAGATCC-3′。

1.6 統計學分析

使用SPSS 22.0進行統計分析，數據均以均數±標準差的形式表示，組間比較使用levene法檢測方差齊性，方差齊時，使用t檢驗；方差不齊，使用近似t檢驗。使用受試者工作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）評估兩類lncRNA的診斷效能，各組數據以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者血漿lncRNA-GAS5和lncRNACCAT1表達水平

與良性肺病組比較，NSCLC患者血漿中lncRNA-GAS5表達顯著下調（t=-5.379，P＜0.05），lncRNA-CCAT1表達水平明顯上調（t=5.721，P＜0.05）。見圖1。

圖1 非小細胞肺癌患者血漿lncRNA-GAS5與lncRNA-CCAT1表達水平

2.2 NSCLC患者血漿lncRNA-GAS5和lncRNACCAT1表達水平與臨床病理參數的關系

根據統計學資料，NSCLC患者血漿lncRNAGAS5表達水平與年齡、性別、組織分型以及臨床分期無關，但與吸煙史相關（P=0.013）；而lncRNACCAT1的表達與年齡、性別、吸煙史、組織分型以及臨床分期均無相關性（P均＞0.05）。見表1。

2.3 血漿 lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原、Cyfra21-1診斷NSCLC的效能比較

ROC曲線分析顯示，單獨檢測時，lncRNAGAS5、lncRNA-CCAT1的AUC分別為0.772（標準誤為0.042，95%CI為0.690～0.855）和0.762（標準誤為0.043，95%CI為0.678～0.846），而癌胚抗原、Cyfra21-1的AUC分別為0.737（標準誤為0.045，95%CI為0.649～0.826）和0.735（標準誤為0.045，95%CI為0.646～0.824），4種指標的AUC無明顯區別（圖2a）。lncRNA-GAS5與lncRNA-CCAT1聯合診斷時的AUC為0.772（標準誤為0.042，95%CI為0.690～0.854），與單獨檢測 lncRNA-GAS5的AUC相等，但高于單獨檢測lncRNACCAT1的AUC（圖2b）。

lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原三者聯合診斷時的AUC為0.870（標準誤為0.032，95%CI為0.807～0.934），lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、Cyfra21-1三者聯合診斷時的AUC為0.840（標準誤為0.034，95%CI為0.772～0.908）。與單指標及兩個指標聯合診斷相比，聯合傳統標志物后AUC提高，聯合癌胚抗原診斷的敏感性顯著升高。根據ROC曲線，找到診斷NSCLC的折點（cut off），并依此計算出敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值及準確性。結果見表2。

圖2 血漿lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原、Cyfra21-1診斷NSCLC的ROC曲線

表2 血漿lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原、Cyfra21-1對NSCLC的診斷效果

3 討論

lncRNA是一類結構類似mRNA、長度大于200個核苷酸的不具有可讀框的轉錄本，可調節細胞分化、增殖、代謝和凋亡等生物學過程，在包括腫瘤等多種疾病發生中扮演重要角色［5-6］。近年來發現lncRNA在多種層面調節基因的表達，并且lncRNA本身也可具有癌基因和抑癌基因的作用。一些lncRNA可在腫瘤中特異性表達，不同腫瘤可能具有不同的lncRNA表達譜［7-9］，因此lncRNA有可能作為包括肺癌在內各種癌癥診斷和治療的靶點。

Huang等［10］用 RNA深度測序（RNA-seq）技術檢測外泌體中的RNA，結果顯示從血漿中分離獲得的外泌體中除有大量miRNA外，還有一些lncRNA（約占3.36%），這為外周血中存在lncRNA提供了直接依據。后續很多相關實驗也再次驗證了這個發現，如Zhang等［11］在乳腺癌患者及健康患者血漿中檢測到H19的表達，并證明其可作為乳腺癌早期篩查和預后監測的潛在生物標志物。楊哲峰等［12］的研究顯示，血漿lncRNA-HEIH的表達與肝癌發生風險呈顯著正相關。上述研究均提示測定血漿中lncRNA對于肺癌的診斷具有可行性。

lncRNA-GAS5在乳腺癌、胃癌、前列腺等多種癌癥中下調［13-15］。有研究顯示［3］，肺癌組織中 lncRNA-GAS5的表達水平顯著低于正常肺組織，肺癌細胞株中lncRNA-GAS5的表達水平明顯低于正常支氣管上皮細胞。Zhang等［16］亦發現，與鄰近正常組織比較，NSCLC組織中lncRNA-GAS5表達水平明顯降低；并且lncRNA-GAS5可抑制自噬，從而增強NSCLC細胞中的順鉑敏感性。Liang等［17］的研究顯示，NSCLC患者血漿lncRNA-GAS5表達較健康者顯著降低，而術后第7天較術前明顯升高。Shi等［18］評估了lncRNA-GAS5表達與臨床病理學參數的相關性（主要為腫瘤分期及是否淋巴結轉移），發現具有較高腫瘤負荷的較大腫瘤或更晚期的腫瘤中表達lncRNA-GAS5水平更加低下。上述研究表明，lncRNA-GAS5可能成為一個較好的診斷早期NSCLC的分子標志物。當然，lncRNA-GAS5并不是在所有的惡性疾病中都呈下調。有研究表明，血漿中lncRNA-GAS5表達水平的增加與多發性骨髓瘤密切相關［19］，這可能是由于不同疾病中lncRNA分泌途徑的差異所導致。

lncRNA-CCAT1最早于2012年在結腸癌中被發現［20］，其在結腸癌組織中的表達比在正常組織中高數倍，而其在染色體上位于轉錄因子c-Myc附近。但作為一種新型lncRNA，相關研究較少。Li等［21］發現lncRNA-CCAT1在57個胃癌組織樣本中的表達高于鄰近正常組織，并進一步分析推測lncRNACCAT1通過負調節miR-219-1促進胃癌發生和進展。另外，lncRNA-CCAT1被證實在肝細胞癌中的表達高于癌旁組織，其作用機制與c-Myc有關，同時lncRNA-CCAT1可作為“分子海綿”與miRNA let-7結合并拮抗其功能，最終促進肝癌細胞的增殖與侵襲［22］。而在肺癌方面，White等［4］對 567例肺腺癌與肺鱗癌轉錄組進行測序，經綜合分析得到了肺癌中失調lncRNA圖譜，在異常表達的111種lncRNA中包括了CCAT1（在兩組肺癌細胞株中表現為高表達）。Lu等［23］發現香煙煙霧提取物能誘導lncRNACCAT1表達增加，而 lncRNA-CCAT1與miRNA let-7c競爭性結合降低了對其靶基因c-Myc的下調，而c-Myc又能反過來作用于lncRNA-CCAT1啟動子區上調其表達，最終這種相互作用引起人類支氣管上皮細胞周期的改變，促進支氣管肺癌的發生。本研究結果顯示，與良性肺病患者比較，NSCLC患者血漿lncRNA-GAS5表達顯著下調，而lncRNA-CCAT1則表現為顯著上調。進一步結合臨床資料分析顯示，NSCLC患者lncRNA-GAS5表達水平與年齡、性別、組織分型、分期無關，但與吸煙史相關（P=0.013），而lncRNA-CCAT1的表達與年齡、性別、吸煙史、組織分型、分期均無相關性。其次，我們發現單獨檢測 lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1，其 AUC僅略高于癌胚抗原及Cyfra21-1，同時根據ROC曲線選取的折點處的敏感性均高于癌胚抗原及Cyfra21-1，但特異性略有不及。聯合檢測lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1時AUC無明顯改變，敏感性進一步得到提升，特異性卻更加下降。高敏感性的標志物更加適用于篩選試驗，但診斷試驗更注重高特異性，lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1聯合傳統腫瘤標志物時診斷效能增加，且敏感性得到明顯提升，特異性保持良好。因此，lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1有潛力與傳統腫瘤標志物聯合應用，成為NSCLC患者篩選及診斷的分子標志物。

本研究結果表明，在NSCLC患者及良性肺病患者血漿中lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1均呈差異性表達，但在分析這兩類基因表達與肺癌分期及肺癌病理分型關系時未發現明顯相關性，單獨檢測或兩者聯合檢測用于診斷時的AUC與傳統腫瘤標志物相比無明顯增加，與其他研究結果不符［17，21］。考慮有以下幾個方面原因：①樣本量不足，可能存在抽樣誤差。②樣本相關特征分布不均：本研究中，大多數患者分布在Ⅲ期和Ⅳ期，Ⅰ和Ⅱ期僅4例，無法分析這兩個指標能否在早期診斷NSCLC中發揮優異表現。③臨床資料收集不完全：很多NSCLC患者不愿行相關檢查（如PET-CT），導致無法分期。④未考慮并發癥的影響：在閱讀相關文獻時，我們發現，許多lncRNA不僅與惡性疾病相關，同樣在良性疾病中也起重要作用，本研究的兩個基因也是如此，這更加對我們的研究添加了許多干擾因素。因此，在后續實驗中，我們將擴大樣本量，注意挑選合適樣本，排除相關干擾因素，為進一步證明血漿lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1在NSCLC診斷中的臨床應用價值提供更有說服力的證據。

綜上所述，我們的研究結果顯示lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1在血漿中能夠被檢測，且在NSCLC患者和良性病變患者血漿中的表達差異具有統計學意義，這兩種基因在診斷NSCLC時具有一定的準確性，聯合診斷時能獲得較高的敏感性。由于目前NSCLC的確診仍需依靠病理學結果，因此，我們認為lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1聯合診斷能在NSCLC篩選試驗中得到良好效果。