腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾ERCC1基因表達(dá)對(duì)逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的效果

田麗娜，徐福強(qiáng)，姬力群，劉小平，單 育，楊菲菲，陳 靜，瞿全新

卵巢癌是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，化療是治療卵巢癌的重要方法，但由于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，因而影響化療效果，導(dǎo)致卵巢癌的總體五年生存率始終徘徊在30%[1]。化療耐藥的產(chǎn)生，尤其是鉑類(lèi)藥物的耐藥是困擾卵巢癌治療的重要難題之一。核苷酸切除修復(fù)(NER)是順鉑耐藥的重要機(jī)制，而ERCC1基因是NER途徑的重要因素，在順鉑耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用[2,3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)重組腺病毒方法干擾ERCC1的表達(dá)，初步探討其在體外逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系 人類(lèi)卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP，中高分化，購(gòu)于北京市腫瘤醫(yī)院藥物研究所。

1.1.2 相關(guān)試劑 注射用順鉑(凍干型)：齊魯制藥廠(批號(hào)為H20023461)。重組腺病毒Ad-hTERT-ERCCl-siRNA及只包含ERCC1啟動(dòng)子的空載體腺病毒：Ad-hTERT由本研究小組前期合成[4]。RPMI-1640培養(yǎng)液、小牛血清與前期實(shí)驗(yàn)相同[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)等方法 細(xì)胞培養(yǎng)、藥物配置、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)、MTT法測(cè)定SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑IC50值、MTT法測(cè)定腺病毒對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的影響、MTT法測(cè)定腺病毒對(duì)SKOV3細(xì)胞順鉑IC50值的影響與前期實(shí)驗(yàn)相同[5]。

1.2.2 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3/DDP細(xì)胞，以1×105/ml濃度每孔500 μl接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，分別用0、80 MOI的重組腺病毒感染細(xì)胞，分為2組。培養(yǎng)4 h后，其中一組細(xì)胞加入順鉑，調(diào)整終濃度為10 μg/ml，培養(yǎng)24 h后，按照Hoechst試劑盒方法固定染色[5]，熒光顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定順鉑及腺病毒作用的細(xì)胞周期與凋亡 將生長(zhǎng)良好的SKOV3/DDP細(xì)胞，以1.6×105/ml濃度6 ml傳代至新培養(yǎng)瓶中，共11瓶，培養(yǎng)24 h后，加入治療藥物，分組方法為：(1)重組腺病毒組，添加重組腺病毒MOI 0、MOI 1、MOI 10、MOI 50、MOI 80；(2)重組腺病毒聯(lián)合順鉑組，在(1)的基礎(chǔ)上添加終濃度為10 μg/ml的順鉑；(3)空載體腺病毒聯(lián)合順鉑組，在順鉑終濃度為10 μg/ml的基礎(chǔ)上添加空載體病毒：MOI 50。以上各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后終止，收集細(xì)胞處理后，按流式細(xì)胞試劑盒操作方法，測(cè)定細(xì)胞凋亡和周期分布[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖采用折線(xiàn)圖方法繪制，回歸方程及IC50采用回歸分析計(jì)算，均數(shù)比較采用單因素方差分析。順鉑濃度與抑制率關(guān)系及腺病毒濃度與細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性關(guān)系采用相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 SKOV3/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)情況 SKOV3/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)良好，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)及形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 SKOV3/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)及形態(tài)

A.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn);B.SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期形態(tài)(×400)

2.2 順鉑和腺病毒對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的影響 SKOV3/DDP細(xì)胞給予順鉑處理后，隨著順鉑濃度的增加，SKOV3/DDP細(xì)胞的存活數(shù)量進(jìn)行性下降，細(xì)胞抑制率逐漸升高，順鉑濃度與SKOV3/DDP細(xì)胞抑制率呈線(xiàn)性正相關(guān)(圖2A)，相關(guān)系數(shù)r=0.9862 (P<0.05)，順鉑IC50為(13.93±0.37)μg/ml，耐藥指數(shù)為1.79。而SKOV3/DDP細(xì)胞給予不同腺病毒處理后，空載體腺病毒組中SKOV3/DDP細(xì)胞的存活數(shù)量無(wú)明顯改變。而重組腺病毒組中，隨著MOI的逐漸增加，SKOV3/DDP細(xì)胞的存活數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞抑制率逐漸升高(圖2B)，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 順鉑和腺病毒對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的影響

A.順鉑對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的抑制率;B.不同腺病毒對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的抑制率

2.3 腺病毒對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響 空載體腺病毒組中SKOV3/DDP細(xì)胞IC50無(wú)明顯變化(圖3A)，對(duì)順鉑的敏感性無(wú)明顯改變(圖3B)。重組腺病毒組中SKOV3/DDP細(xì)胞IC50進(jìn)行性下降，并且呈濃度相關(guān)性(r=0.9786，P<0.05)，兩組間結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3A)，MOI 80時(shí)耐藥指數(shù)為1.19。SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性隨病毒濃度的增加而增加，分別增加了11.1%(t=9.757，P<0.05)、16.7%(t=15.07，P<0.05)、26.4%(t=22.183，P<0.05)、33.5%(t=24.921，P<0.05) ，并呈濃度相關(guān)性(r=0.9716，P<0.05) (圖3B)。

圖3 腺病毒對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響

A.感染病毒后SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑的IC50變化；B.感染病毒后SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化

2.4 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)Hoechst染色后，熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞呈藍(lán)色。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)固縮，胞核致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色略發(fā)白。正常SKOV3/DDP僅偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞核(圖4A)，順鉑組可見(jiàn)一些細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(圖4B)，重組腺病毒處理組SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡較正常組增多(圖4C)，順鉑聯(lián)合腺病毒干預(yù)后，SKOV3/DDP細(xì)胞活力下降，細(xì)胞形態(tài)皺縮，邊緣不整，并出現(xiàn)凋亡小體，此為細(xì)胞凋亡的特征，凋亡細(xì)胞明顯增多(圖4D)。

圖4 SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

A.正常SKOV3/DDP細(xì)胞; B.DDP 10μg/ml; C.重組腺病毒MOI 80; D.DDP 10μg/ml+重組腺病毒MOI 80

2.5 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)測(cè)得SKOV3/DDP細(xì)胞G1、S和G2/M期細(xì)胞分別為56.56%、32.62%和10.82%，凋亡率為28.13%(圖5 A-D)。

SKOV3/DDP細(xì)胞不同MOI的重組腺病毒感染后，細(xì)胞周期左移，G1期比例稍有減少(圖5A)，S期比例有所增加(圖5B)，細(xì)胞凋亡率有所增高 (圖5D)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

與SKOV3/DDP細(xì)胞相比，單純順鉑作用的SKOV3/DDP細(xì)胞，G1期細(xì)胞比例減少 (圖5A), S期細(xì)胞比例增高 (圖5B)，G2/M期比例有所增加 (圖5C)，凋亡率增高(圖5，D)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

重組腺病毒聯(lián)合順鉑作用下，SKOV3/DDP細(xì)胞的Gl期比例增加 (圖5A)，S期比例一定程度增加 (圖5B)，G2/M期比例明顯減少 (圖5C)，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加 (圖5D)，與單純順鉑作用組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而空載體病毒聯(lián)合順鉑作用下SKOV3/DDP細(xì)胞，與單獨(dú)順鉑治療組相比，細(xì)胞周期分布相近，細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯改變(圖5E)，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖5 流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定順鉑及腺病毒作用的細(xì)胞周期與凋亡結(jié)果

A.不同處理后SKOV3/DDP細(xì)胞G1期的比率;B.不同處理后SKOV3/DDP細(xì)胞S期的比率; C.不同處理后SKOV3/DDP細(xì)胞G2/M期的比率; D.不同處理后SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡率;E.不同處理后SKOV3/DDP細(xì)胞周期比率及凋亡率

3 討 論

卵巢癌是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，化療是治療卵巢癌的重要方法，但由于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，目前已知，NER是順鉑耐藥的重要機(jī)制之一，而ERCC1是NER途徑的重要因素，在順鉑耐藥中起著重要作用[6-8]。唐琳等[9]用組織芯片儀制備組織芯片并結(jié)合免疫組化方法技術(shù)，檢測(cè)56例卵巢上皮性癌患者組織中ERCC1蛋白的表達(dá)情況，并以38例正常卵巢組織作為對(duì)照，分析其與順鉑化療耐藥的關(guān)系，結(jié)果證實(shí)上皮性卵巢癌ERCC1表達(dá)與順鉑化療耐藥相關(guān)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的改進(jìn)，人類(lèi)基因組測(cè)序工作完成，部分基因治療已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，而且已在多種基因治療的基礎(chǔ)性研究中顯露鋒芒。例如，陳國(guó)強(qiáng)等[10]實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，RCC1的表達(dá)水平與復(fù)發(fā)性卵巢上皮癌患者耐藥性產(chǎn)生相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒感染人卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞株的方法，干擾ERCC1的表達(dá)，觀察其體外逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑耐藥的效果。

采用重組腺病毒載體感染卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載體腺病毒對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，而重組腺病毒具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，具有劑量依賴(lài)性，SKOV3/DDP在感染了重組腺病毒后，其對(duì)順鉑的IC50逐漸下降，順鉑的敏感性逐漸增加，耐藥指數(shù)由1.79降低為1.19，接近敏感株水平[5]，組腺病毒干擾ERCC1表達(dá)后對(duì)SKOV3/DDP具有逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥作用，并且呈劑量依賴(lài)性。通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒載體感染的細(xì)胞變圓，體積稍大，細(xì)胞間的連接較疏松，表明抑制ERCCl基因表達(dá)，使耐藥腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到一定的抑制，高于重組腺病毒對(duì)敏感株的抑制作用，這可能與端粒酶的活性與卵巢癌細(xì)胞株的耐藥性有關(guān)[11]。

流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常生長(zhǎng)狀態(tài)下SKOV3/DDP細(xì)胞多數(shù)處于G1期，S期次之，G2/M期最少，細(xì)胞增生活躍程度弱于敏感株，與耐藥株倍增時(shí)間大于敏感株一致[5]。重組腺病毒對(duì)耐藥株SKOV3/DDP細(xì)胞具有較弱S期阻滯和誘導(dǎo)凋亡的作用。順鉑對(duì)耐藥株SKOV3/DDP細(xì)胞的S期阻滯作用及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用弱于敏感株SKOV3細(xì)胞，由此導(dǎo)致SKOV3/DDP對(duì)順鉑耐藥。而重組腺病毒聯(lián)合順鉑作用下，SKOV3/DDP細(xì)胞周期阻滯于S期比例增加，細(xì)胞凋亡率增高，表明重組腺病毒通過(guò)干擾ERCCl基因表達(dá)，增加順鉑對(duì)耐藥株的S期的阻滯、抑制細(xì)胞DNA復(fù)制、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。重組腺病毒干擾ERCCl基因表達(dá)，逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥可能與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期分布及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，重組腺病毒可以通過(guò)抑制卵巢癌細(xì)胞ERCC1基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡等途徑部分逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥。本研究將RNA干擾技術(shù)與基因重組及基因載體技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，為基因治療逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑化療耐藥提供了新的思路，為以ERCC1基因?yàn)榘谢蛑委熉殉舶⒛孓D(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但還是需要進(jìn)行深入的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，來(lái)確證以ERCC1為靶基因的RNA干擾方法治療卵巢癌、逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的有效性。