不同產地葡萄藤莖中白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量測定

宋 菲，賀凌霜，孫華庚，趙艷敏，，劉 丹，付 山，劉岱琳

白藜蘆醇，化學名為3，4′，5- 三羥基二苯乙烯，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等多種植物中，目前已發現至少在34個科、69個屬、100種植物中含有該成分[1]。白藜蘆醇是植物受到環境中的外界刺激或真菌、細菌感染等病理性因素攻擊時產生的一種植物抗毒素。近年來，學者發現它不僅分布在葡萄果實中，而且在葡萄植株的葉片、藤莖中均有分布[2,3]。隨著對白藜蘆醇關注度的增加，學者陸續又從葡萄屬植物的藤莖中發現了白藜蘆醇的二聚體ε-葡萄素和δ-葡萄素、三聚體α-葡萄素等具有一定聚合度的葡萄素類成分[4-6]。ε-葡萄素在保護心血管、抗氧化、抗炎作用等方面都優于白藜蘆醇[10]，也是一個非常有潛力的多酚類代表性化合物。目前，尚沒有關于葡萄藤莖中白藜蘆醇和葡萄素類成分含量分布與產地關系的相關研究，本文利用HPLC建立葡萄藤莖中白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量測定方法，并對來自不同地區的六種玫瑰香葡萄藤莖中白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量進行測定分析，以期為后續以葡萄藤莖為原料提取開發白藜蘆醇和ε-葡萄素提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 來自天津、秦皇島和新疆三個產地的10個玫瑰香葡萄藤莖樣品購自天津市尖峰天然產物研究開發有限公司。白藜蘆醇和ε-葡萄素購自天津市科曼思特醫藥科技發展有限公司(含量95%)。甲醇購自天津市康科德科技有限公司，冰乙酸購自天津市化學試劑五廠。純凈水使用娃哈哈牌純凈水。

KQ-500型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；高效液相色譜儀[(泵：LC-20AT型，檢測器：SPD-M20A，柱溫箱：CTO-20A，控制器：CBM-20A)日本島津公司]；AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；DGG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗準備 準備來自天津市茶淀葡萄園、河北省秦皇島地區葡萄園、新疆地區葡萄園獲得的不同產地的玫瑰香葡萄藤莖10個樣品，所有品種的葡萄植株進行分類、晾干，放入烘箱中，在40 ℃恒溫下烘干4 h，然后將溫度升至60 ℃繼續烘干2 h后，取出粉碎，過60 目篩，密封貯于干燥器中備用。精密稱取白藜蘆醇標準品17.61 mg置于10 ml容量瓶中，甲醇充分溶解并定容至刻度，配成濃度為1.761 mg/ml的白藜蘆醇標準品貯備液。精密稱取ε-葡萄素標準品27.54 mg置于10 ml容量瓶中，甲醇充分溶解并定容至刻度，配成濃度為0.2754 mg/ml的ε-葡萄素標準品貯備液。

分別精密稱取不同產地的葡萄藤原料2 g，置于100 ml棕色容量瓶中，加入60 ml甲醇回流提取2 h，取出放涼至室溫，加入甲醇定容，得到樣品溶液。測試前，過0.45 m微孔濾膜，吸取續濾液測定。

1.3 色譜分析條件 COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ色譜柱(250 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃ ，檢測波長為254 nm和310 nm，進樣量為20 μl。洗脫流動相：A相為1%醋酸水溶液，B相為1%醋酸甲醇溶液。洗脫梯度為：0～5 min，20%～30%B；5～15 min，30%B；15～18 min，30%～37%B；18～30 min，37%B；30～35 min，37%～50% B；35～55 min，50%B；55～58 min，50%～100%B；58～60 min，100%B；60～61 min, 100%～20%B；61～65 min, 20%B。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準曲線的制作 分別精密吸取白藜蘆醇和ε-葡萄素標準品溶液1 ml，用甲醇稀釋成五個不同濃度進樣分析，在310 nm 波長下查看白藜蘆醇標準品的峰面積，在254 nm波長下查看ε-葡萄素標準品的峰面積。分別以白藜蘆醇和ε-葡萄素的質量X(μg)和峰面積Y(mAU)為縱坐標，建立線性回歸方程。

1.4.2 精密度實驗 分別對同一濃度的白藜蘆醇標準品和ε-葡萄素標準品各重復進樣6次，測定白藜蘆醇和ε-葡萄素標準品的峰面積和保留時間，計算RSD值。

1.4.3 穩定性實驗 取同一批的葡萄藤莖樣品2 g，制備供試品溶液，按照相同色譜分析條件分別于0、2、4、6、8、10 h測定白藜蘆醇和ε-葡萄素兩種成分的峰面積值，計算RSD值，從而考察樣品測定條件的穩定性。

1.4.4 重復性試驗 取同一批的葡萄藤莖樣品2 g，制備供試品溶液6份，按照相同色譜條件測定白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量，并計算RSD值，從而考察試驗條件的重現性。

1.4.5 回收率實驗 精密稱取已知白藜蘆醇和ε-葡萄素含量的葡萄藤莖樣品2 g，分別加入相當于樣品中白藜蘆醇和ε-葡萄素含量的80%、100%、120%的對照品，配置待測溶液，按照相同色譜條件測定樣品中白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量，并計算加樣回收率。每組實驗平行進行3次。

2 結 果

2.1 標準曲線的繪制 結果顯示，白藜蘆醇在1.76～17.6 μg質量范圍內與峰面積呈現良好的線性關系，回歸方程為Y=7.73×107X-272530，R2=0.9999。ε-葡萄素在2.75～27.54 μg范圍內與峰面積呈現良好的線性關系，回歸方程為Y=1.12×105X-16088，R2=0.9999。樣品和標準品色譜圖見圖1。

圖1 葡萄藤樣品和白藜蘆醇、ε-葡萄素標準品的HPLC色譜圖

精密度試驗結果顯示6次測量值的白藜蘆醇的RSD=0.57%，ε-葡萄素的RSD=0.41%，表明在該條件下儀器精密度良好。穩定性試驗測定結果顯示葡萄藤莖樣品溶液中的白藜蘆醇和ε-葡萄素兩種成分在10 h內穩定，其RSD值分別為1.21%和1.85%。重復性試驗測定結果顯示該方法重現性良好，其RSD值分別為2.11%和2.72%，符合方法學的要求。

2.2 加樣回收率實驗 產自新疆的玫瑰香葡萄藤莖樣品的測定結果及加標回收率試驗如表1所示，結果顯示白藜蘆醇含量為5.96 μg/g，平均回收率為102.7%，RSD為2.32%；ε-葡萄素的含量為14.62 μg/g，平均回收率為101.2%，RSD為3.54%，測試結果顯示樣品處理方法可以滿足葡萄中白藜蘆醇ε-葡萄素的測定分析。

2.3 不同產地葡萄藤莖中白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量 不同產地的葡萄藤莖中白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量測定結果見表2。

通過三個地區的10個玫瑰香葡萄藤莖的品種中白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量測定，白藜蘆醇的含量范圍在1.94～5.96 μg/g，平均含量為3.32 μg/g，含量的變異系數為40.64%。ε-葡萄素的含量范圍在8.74～15.41 μg/g，平均含量為12.51 μg/g，含量的變異系數為17.67%。同為玫瑰香葡萄植物的藤莖，其生長環境的不同，在不同產地，其有效成分白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量差異還是較大的。

表1 白藜蘆醇和ε-葡萄素加樣回收率實驗結果

表2 不同產地的葡萄藤莖中白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量 (μg/g)

3 討 論

試驗過程中發現，葡萄藤莖樣品在提取過程中采用95%乙醇和甲醇分別作為溶劑進行提取，通過比較發現甲醇的提取效率更高，因此在樣品的前處理過程中選取甲醇作為提取溶劑。

葡萄果實品種不同，其白藜蘆醇的含量差異也較大。周曉明等[8]測定了40余種葡萄果實中白藜蘆醇的含量，品種間含量的變異系數可以達到32.5%，含量最高的是京紫晶葡萄，白藜蘆醇可以達到9.041 μg/g。葡萄不同品種和組織間白藜蘆醇含量差異顯著，陳夢微等[9]調查了6個品種葡萄各組織中含量，發現果梗>果皮>種籽，其中金田0608和夏黑果梗白藜蘆醇含量較高(22.4～22.6) μg/g，陽光玫瑰和白羅莎里奧果梗藜蘆醇含量很低(1.2～1.8)μg/g，之前還有陳雷等[10]報道了米勒葡萄果皮中白藜蘆醇含量很高，可以達到43.56 μg/g。這些研究多集中于葡萄果梗、果皮和種子，但是葡萄藤莖的研究相對較少，吳艷麗等[11]使用HPLC測定了藥廠提供的四批山葡萄藤樣品中白藜蘆醇的含量，白藜蘆醇的含量差異0.0641%到0.2901%，含量差異很大。楊榮艷等[12]報道了10批山葡萄藤中白藜蘆醇平均含量為0.48%，但是卻沒有報道其中ε-葡萄素的含量。謝紅旗等[13]考察了不同前處理方法對葡萄藤莖中白藜蘆醇等芪類化合物的含量影響，不同的處理方法可以影響到植物中白藜蘆醇等芪類化合物的含量變化。本文則首次考察了來自不同產地的10個玫瑰香葡萄的藤莖樣品中白藜蘆醇及其二聚體ε-葡萄素的含量，研究結果發現新疆地區產的玫瑰香葡萄的藤莖中白藜蘆醇和ε-葡萄素的含量相對較高，最高值可以達到白藜蘆醇5.96 μg/g，ε-葡萄素可以達到15.41 μg/g，可以作為天然白藜蘆醇和ε-葡萄素開發利用的植物資源。

已有實驗表明，白藜蘆醇在抗肝癌、乳腺癌、結腸癌等方面具有促使癌細胞凋亡的藥理作用[14-16]，被喻為繼“紫杉醇”之后的又一新的綠色抗癌物質[17]。徐峰等通過實驗證明白藜蘆醇能夠降低高糖環境下原代大鼠系膜細胞的炎性反應和細胞增殖，有效減輕糖尿病腎炎，同時，在治療慢性腎功能衰竭常用注射劑腎炎康[18]中也提取到了有效成分白藜蘆醇-4′-O-葡萄糖苷。綜上所述，白藜蘆醇作為一種天然的多酚類化合物具有抗氧化、抗菌、抗癌、降血脂、保護心血管、延緩衰老、提高機體免疫力等多種功效[19,20]，其在醫藥、保健食品領域具有很廣闊的開發前景。本研究結果為葡萄藤莖提取白藜蘆醇的開發利用提供了實驗依據。