差異致齲性變形鏈球菌細(xì)胞外蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究*

戴煦原 崔 偉 楊 光 王成龍

齲病是一種牙體硬組織的慢性破壞性疾病，變形鏈球菌是導(dǎo)致齲病發(fā)生發(fā)展的主要致齲菌[1～3]。對(duì)于變形鏈球菌致齲因子的結(jié)構(gòu)和功能，包括葡糖基轉(zhuǎn)移酶[4～6]、表面抗原AgI/II蛋白家族[7,8]、葡聚糖結(jié)合蛋白[9,10]以及群體感應(yīng)密切相關(guān)LuxS蛋白和信號(hào)分子AI-2[11]等，學(xué)者們已經(jīng)有了比較明確的認(rèn)識(shí)。但是基于變形鏈球菌致齲因子的齲病防治效果還不能令人滿(mǎn)意[4,9,12,13]。

分泌蛋白質(zhì)組(Secretome)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容，是對(duì)細(xì)胞釋放到胞外的全部蛋白質(zhì)(細(xì)胞外蛋白)的研究。病原菌的分泌蛋白質(zhì)往往含有致病或毒性因子，與疾病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理的研究等具有重要意義[14～18]。關(guān)于變形鏈球菌分泌蛋白質(zhì)組研究，目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

我們?cè)谇捌谘芯抗ぷ鱗19]的基礎(chǔ)上，研究高、低致齲性變形鏈球菌細(xì)胞外蛋白質(zhì)的差異，希望能夠發(fā)現(xiàn)除GTF、GBPs等致齲因子外，不同致齲性變形鏈球菌差異表達(dá)的蛋白并為這些差異表達(dá)蛋白在致齲過(guò)程中的作用及其機(jī)理研究打下基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 菌株 變形鏈球菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株Streptococcus mutans Ingbritt(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所提供)，低致齲性臨床分離株4號(hào)、高致齲性臨床分離株5號(hào)[19,20](本課題組保存)。

1.2 主要儀器 ImageMaster 2Dplatinum雙向電泳凝膠圖像分析軟件；Burke公司REFLEXTMIII型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDITOF-MS)；Micromass公司ESI-MS/MS(Q-TOF 2)質(zhì)譜儀；Bio-Rad Protena II型垂直電泳儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 變形鏈球菌細(xì)胞外蛋白制備 參照Liu Y等的 TCA(三氯乙酸)法[21]。

1.3.2 雙向電泳 第一向等電聚焦；第二向SDS-PAGE電泳。

1.3.3 銀染色

1.3.4 ImageMaster 2D platinum軟件分析雙向電泳凝膠圖像 運(yùn)用Image Master 2D Platinum軟件對(duì)電泳凝膠圖像蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)、量化、背景扣除、匹配，自動(dòng)檢測(cè)后手工校對(duì)，取4號(hào)菌株凝膠圖像作為參考凝膠，5號(hào)菌株凝膠圖像與之匹配。

1.3.5 質(zhì)譜分析 ESI-MS/MS正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有毛細(xì)管液相色譜和納升噴霧源，所有測(cè)定均為正離子模式，霧化氣體為N2，碰撞氣體為H2，源溫80℃，錐孔電壓50V，TOF加速電壓9.1kV，MCP檢測(cè)器電壓2200V。取4ul樣本，900V毛細(xì)管電壓，檢測(cè)獲得串聯(lián)質(zhì)譜圖，經(jīng)過(guò)MaxEnt3處理后，使用MasSeq推導(dǎo)出肽段序列。

1.3.6 變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株S1基因克隆、重組表達(dá)S1蛋白純化 以變形鏈球菌Ingbritt基因組為模板，設(shè)計(jì)合成S1特異性引物，5'F NdeI：CATA TGATGAATGAATTTGAAGA，3'R XhoI：CTC GAGTTATAATTCAATATCAC，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到S1基因。PCR條件為94℃變性，55℃退火，72℃延伸，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增得到的S1片段用NdeI和XhoI酶切分子克隆至pET-28a載體，將所得表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)菌落PCR和基因測(cè)序鑒定序列正確性。挑取pET-28a-S1-BL21陽(yáng)性克隆于LB(kana+)培養(yǎng)基，37℃220rpm搖床過(guò)夜，以1∶100比例接入到新的LB(kana+)培養(yǎng)基中，37℃220rpm搖床培養(yǎng)約1.5小時(shí)，OD600約為0.6時(shí)，加入1mM IPTG，繼續(xù)37℃220rpm搖床培養(yǎng)6h，所得菌液5000rpm離心5min去上清，ddH2O重懸后超聲裂解，Ni親和樹(shù)脂柱親和純化于裂解液上清的目的蛋白。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 變形鏈球菌細(xì)胞外蛋白的制備 通過(guò)TCA沉淀法處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的4、5號(hào)變形鏈球菌菌液分別獲得兩菌株的細(xì)胞外蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，4、5號(hào)菌的細(xì)胞外蛋白的電泳凝膠圖像可見(jiàn)蛋白條帶存在差異。

2.2 變鏈菌細(xì)胞外蛋白雙向電泳 對(duì)獲得的細(xì)胞外蛋白樣本進(jìn)行了雙向電泳，分析凝膠圖像(圖1)：

蛋白點(diǎn)匹配率76%。以蛋白量有3倍以上差異為標(biāo)準(zhǔn)，其中4號(hào)菌株有高表達(dá)蛋白點(diǎn)10個(gè)(圖1A)，5號(hào)菌株有高表達(dá)蛋白點(diǎn)4個(gè)。同時(shí)5號(hào)菌株有特異表達(dá)蛋白點(diǎn)4個(gè)(圖1B)。

圖1 變形鏈球菌細(xì)胞外蛋白雙向電泳

我們挖取了5號(hào)菌株電泳的2個(gè)高表達(dá)蛋白點(diǎn)和2個(gè)特異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析(圖2)，分別標(biāo)記為 70、71、72、73。

圖2 質(zhì)譜分析位點(diǎn)

2.3 質(zhì)譜分析 通過(guò)對(duì)4個(gè)差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜分析獲得以下結(jié)果(表1)。

表1 差異致齲性變形鏈球菌細(xì)胞外蛋白質(zhì)譜分析表

2.4 重組表達(dá)S1蛋白 我們利用變形鏈球菌基因組為模板，使用S1特異性引物，PCR釣取S1片斷(圖3)，測(cè)序鑒定序列正確，構(gòu)建pET-28a-S1表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR(圖4)及測(cè)序鑒定：pET-28a-S1表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 PCR釣取S1片段

圖4 pET-28a-S1-BL21菌落PCR

測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆成功在37℃、1mM IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)分子量大約為50kDa的S1蛋白。利用pET-28a載體表達(dá)系統(tǒng)自帶的his標(biāo)簽，使用Ni離子螯合柱成功純化獲得了純度較高的重組表達(dá)S1 蛋白(圖 5)。

圖5 S1蛋白重組表達(dá)SDS電泳圖

3.討論

蛋白質(zhì)組學(xué)研究是對(duì)蛋白質(zhì)的成分、表達(dá)和修飾的動(dòng)態(tài)變化從整體水平進(jìn)行的研究。既往變形鏈球菌的蛋白組學(xué)的相關(guān)研究多為關(guān)于突變株[16]蛋白表達(dá)差異、不同生存條件下[22]的蛋白表達(dá)差異以及不同黏附狀態(tài)下[23]的蛋白表達(dá)差異的研究。而使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究不同致齲性變形鏈球菌差異蛋白對(duì)于致齲因子和齲病發(fā)病機(jī)理研究意義更大。

趙興福，黃曉晶等[15]的研究顯示來(lái)自高齲患者和無(wú)齲者的血清C型變形鏈球菌的臨床分離株的蛋白表達(dá)有差異。在本研究中，也得到了相似的研究結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)不同致齲性變形鏈球菌的細(xì)胞外蛋白表達(dá)存在差異。對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行深入分析研究，特別是高致齲性變形鏈球菌的高表達(dá)蛋白，有可能發(fā)現(xiàn)新的致齲因子及其在齲病發(fā)病中的重要作用。因此我們對(duì)高低致齲性變形鏈球菌的細(xì)胞外蛋白分別進(jìn)行雙向電泳，獲得了低致齲性菌株的10個(gè)高表達(dá)蛋白點(diǎn)，高致齲性菌株的4個(gè)高表達(dá)蛋白點(diǎn)4個(gè)特異表達(dá)蛋白點(diǎn)。這些差異蛋白點(diǎn)，理論上說(shuō)，對(duì)于變形鏈球菌致齲性都具有一定的意義，由于研究條件的限制，我們僅選擇了高致齲性變形鏈球菌的4個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析以確定具體蛋白。

我們通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)從4個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)中檢測(cè)得到22種蛋白質(zhì)，這其中包含已知的致齲因子葡糖基轉(zhuǎn)移酶、葡聚糖結(jié)合蛋白等，這些蛋白的出現(xiàn)，一方面說(shuō)明這些公認(rèn)的致齲因子在變形鏈球菌致齲過(guò)程中確實(shí)起著不可忽視的作用，另一方面也從側(cè)面證實(shí)我們使用的研究方法在尋找與變形鏈球菌致齲性差異相關(guān)因子方面是有效的。質(zhì)譜分析結(jié)果中也還包含目前在變形鏈球菌研究中還未被提及的蛋白。理論上說(shuō)這些蛋白應(yīng)該是我們研究的重點(diǎn)，深入研究這些蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，有可能從中發(fā)現(xiàn)新的與變形鏈球菌致齲相關(guān)的蛋白。

30S ribosomal protein S1(S1)蛋白是我們研究中發(fā)現(xiàn)的目前在變形鏈球菌研究中還未被提及的一個(gè)蛋白，S1蛋白是參與核糖體構(gòu)成的重要亞單位，該蛋白無(wú)論在原核生物還是在真核生物中，都在生物體的生長(zhǎng)代謝過(guò)程中起著重要作用[24,25]。迄今為止，關(guān)于變形鏈球菌中S1蛋白的生物學(xué)功能尚無(wú)具體研究，我們推測(cè)在不同致齲性變形鏈球菌中表達(dá)有差異的S1蛋白有可能在變形鏈球菌致齲過(guò)程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用，很可能是我們還沒(méi)有認(rèn)識(shí)到的致齲相關(guān)因子。

我們根據(jù)NCBI genbank的S1基因序列設(shè)計(jì)引物，從變形鏈球菌全基因組上PCR釣取S1基因片段，并以此構(gòu)建了pET-28a-S1-BL21工程菌，成功重組表達(dá)了S1蛋白，這些工作為我們接下來(lái)對(duì)S1蛋白的功能研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

我們對(duì)不同致齲性變形鏈球菌細(xì)胞外蛋白質(zhì)組的研究，獲得了大量有意義的信息，但是由于條件的限制，我們只對(duì)其中的極少部分信息進(jìn)行了研究，其余大量信息，如低致齲性變形鏈球菌的10個(gè)高表達(dá)蛋白點(diǎn)，高致齲性變形鏈球菌剩余的高表達(dá)和特異表達(dá)蛋白點(diǎn)未能進(jìn)行質(zhì)譜分析，這些蛋白點(diǎn)中有可能包含更多的變形鏈球菌致齲能力高低相關(guān)的信息；進(jìn)行質(zhì)譜分析的4個(gè)高致齲變形鏈球菌差異表達(dá)蛋白點(diǎn)得到的22個(gè)蛋白中，我們也只對(duì)其中的S1蛋白成功的克隆、表達(dá)和純化。深入的功能研究還在進(jìn)行中，我們將繼續(xù)利用得到的不同致齲性變形鏈球菌之間的細(xì)胞外蛋白質(zhì)組學(xué)信息進(jìn)行分析，希望能夠?qū)x病發(fā)病機(jī)理的研究做出我們的貢獻(xiàn)。