LC-MS/MS技術(shù)在獸藥殘留定性定量檢測中的應(yīng)用

李 芮

（四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都 615000）

隨著色譜和質(zhì)譜技術(shù)的日趨成熟，大量樣品前處理新裝置、新技術(shù)研發(fā)成功并很快商品化，使得獸藥殘留檢測方法出現(xiàn)下面新特點：樣品前處理，尤其是凈化方式多樣化；超高效液相色譜的出現(xiàn)使得分析速度大大提高；質(zhì)譜的發(fā)展使得方法靈敏度逐步提高；多殘留分析方法漸多；目前，絕大多數(shù)種類的獸藥都可以采用LC-MS/MS法進(jìn)行定性定量檢測。

1 相關(guān)概念

動物源性食品：全部可食用的動物組織以及蛋和奶。包括動物肌肉、肝、腎、脂肪、奶、蛋、蜂蜜等。

獸藥殘留：可食用動物用藥后，動物產(chǎn)品的任何食用部分中與所有藥物有關(guān)的物質(zhì)殘留，包括原型藥物或/和其代謝產(chǎn)物。

殘留標(biāo)示物：指在靶組織中殘留時間最長的藥物，可能是原型藥物、代謝物、藥物原形和代謝物。大多數(shù)藥物的殘留標(biāo)示物是原型。例如，標(biāo)示物為代謝物的有硝基呋喃類、喹噁啉類等，而標(biāo)示物為原形和代謝物之和的有苯并咪唑類、恩諾沙星等。

最高殘留限量（MRL）：對食品動物用藥后產(chǎn)生的允許存在于食物表面或內(nèi)部的該獸藥殘留的最高量/濃度（以鮮重計，表示為□g/kg）。MRL只對允許使用的藥物而言。

獸藥殘留標(biāo)示物決定了動物性食品殘留檢測的目標(biāo)物，MRL決定了殘留檢測的結(jié)果是否合格，是否滿足食品安全要求。

2 殘留角度獸藥分類

我國農(nóng)業(yè)部235號公告（2002年）將獸藥分為四類：第一類：食品動物允許使用，但不需要制定殘留限量的藥物，共80種（類），標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了藥物名稱，動物種類，限用的給藥途徑、禁用動物等規(guī)定。第二類：已批準(zhǔn)使用的獸藥，在動物性食品中的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，共94種（類）獸藥的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了藥物名稱、標(biāo)志殘留物、動物種類、靶組織以及殘留限量。第三類：允許作治療使用，但在動物性食品中不得檢出的獸藥，共9種。第四類：禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出的化合物，共19種（類）。

我國限用藥物檢測結(jié)果的判定為超過MRL即不合格。而禁用藥物檢測結(jié)果的判定，規(guī)定了判定限，對于禁用藥物或允許作治療使用，但不得在動物性食品中檢出的藥物，政府通常指定的樣品中至少必須檢出和能被確證的分析物的最小含量。例如β-受體激動劑的判定限為1或0.5μg/kg，氯霉素為0.3μg/kg，硝基呋喃代謝物為1μg/kg。

3 獸藥殘留的檢測方法

（1）獸藥殘留檢測的主要特點：待測物濃度低，殘留量一般為μg/kg（ppb），甚至納克/kg；樣品基質(zhì)復(fù)雜，動物組織多樣，干擾物質(zhì)多，如肝臟和腎臟；殘留標(biāo)示物形式多樣，有原形和/或代謝產(chǎn)物，不同動物代謝產(chǎn)物也存在差異；前處理時間較長，一般都要經(jīng)過提取凈化等多個步驟；對從業(yè)人員有毒害，分析過程常用到甲醇、乙腈、氯仿等有毒有害化學(xué)試劑，需要相應(yīng)的防護(hù)措施。

（2）獸藥殘留檢測的主要過程：主要包括樣品制備，分解和提取，分離和富集，最后是樣品分析。在儀器分析之前，通常需要提取和純化樣品。大多數(shù)樣品需要采用的預(yù)處理步驟由樣品基質(zhì)和分析物性質(zhì)決定。目前，較常使用的樣品處理技術(shù)是液液萃取（LLE）和液固萃取（LSE）組合使用。通過使用合適的有機(jī)溶劑進(jìn)行脫蛋白/分析提取物和除去溶劑后（LLE），隨后通過使用合適的固相萃取（SPE）程序純化提取物。

（3）獸藥殘留檢測方法制修訂依據(jù)：我國農(nóng)牧發(fā)[2003]1號文《獸藥殘留試驗技術(shù)規(guī)范（試行）》規(guī)定了獸藥在食品動物的主要代謝物或標(biāo)志殘留物的確定、MRL的確定方法、殘留檢測方法的建立、可食性組織和給藥部位的殘留濃度及消除規(guī)律試驗方法、休藥期的確定方法以及殘留試驗申報材料的具體要求。

（4）獸藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)方法制修訂的技術(shù)參數(shù)：包括方法的靈敏度、檢測限、定量限、線性、準(zhǔn)確度和緊密度等。目前，靈敏度一般采用信噪比（S/N）法。檢測限為3倍信噪比（S/N=3）相對應(yīng)的空白組織添加濃度。定量限為10倍信噪比（S/N=10）相對應(yīng)的空白組織添加濃度。線性包括標(biāo)液標(biāo)準(zhǔn)曲線、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線等。標(biāo)準(zhǔn)曲線至少5個濃度水平，一般5～7個，線性范圍要涵蓋方法定量限和2倍MRL所對應(yīng)的濃度水平。給出線性回歸方程y=ax+b，相關(guān)系數(shù)（R2）至少要大于0.990。而準(zhǔn)確度用回收率表示，回收率一般至少添加3個濃度水平，分別為定量限、1倍MRL和2倍MRL，也可另添加1/2倍MRL。精密度用變異系數(shù)表示，每批做5-7個重復(fù)（n=5-7），連做至少3d，計算每個濃度水平上n個樣品的回收率、平均回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）。

（5）我國獸藥殘留檢測方法概況：從檢測方法原理上，可分為三類。理化分析法，主要有LC、LC-MS/MS、GC、GC/MS等。免疫分析法，主要包括ELISA法、熒光免疫測定法等。微生物法，主要有杯蝶法、活體動物拭子試驗法等。

4 LC-MS/MS技術(shù)在定性定量檢測中的應(yīng)用

LC-MS/MS技術(shù)定性檢測的法規(guī)要求，鑒別點（IPs）最低要求為規(guī)定殘留限量的藥物3個IPs，而禁用藥則需4個IPs。LC-MS/MS的質(zhì)量碎片類型有母離子和子離子兩種，離子數(shù)為1個母離子，2個子離子，低分辨質(zhì)譜的母離子的識別點為1.0，而子離子的識別點為1.5，因此可得低分辨質(zhì)譜識別點數(shù)為4，而高分辨質(zhì)譜的離子識別點為低分辨質(zhì)譜的兩倍。可見LC-MS/MS技術(shù)是符合法規(guī)要求的。

4.1 LC-MS/MS技術(shù)的工作原理

被測組分經(jīng)過液相色譜（LC）分離后，進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，在離子源將分析物由液態(tài)轉(zhuǎn)換為氣態(tài)帶電離子，即準(zhǔn)分子離子，經(jīng)一級質(zhì)量分析器（MS1）根據(jù)質(zhì)核比（m/z）進(jìn)行分離，得到的母離子進(jìn)入碰撞室進(jìn)行誘導(dǎo)解離，產(chǎn)生的特征碎片離子在二級質(zhì)量分析器（MS2）進(jìn)行分離。

LC-MS/MS技術(shù)的優(yōu)點是通過選擇檢測MS1和MS2，可以給出準(zhǔn)確的定性所需離子信息，有效降低本底噪音的干擾，在很大程度上提高檢測靈敏度，且分析目標(biāo)化合物的范圍大，成為獸藥殘留檢測的優(yōu)選方法。而缺點是離子源存在基質(zhì)效應(yīng)，影響定量結(jié)果。

4.2 LC-MS/MS技術(shù)的基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是指在樣品測試過程中，由于待測物以外其他物質(zhì)的存在，直接或間接影響待測物響應(yīng)的現(xiàn)象。包括基質(zhì)抑制效應(yīng)和基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

引起基質(zhì)效應(yīng)的原因主要有：待測物與樣品基質(zhì)成分在離子源離子化過程中競爭帶電引起；樣品中含有的內(nèi)源性物質(zhì)或體內(nèi)藥物的多個代謝產(chǎn)物或其他同類藥物引起；前處理過程中塑料管內(nèi)殘留的聚合物、有機(jī)酸、緩沖液、SPE柱材料等引起。

而ME對方法準(zhǔn)確度和精密度影響最大，消除基質(zhì)效應(yīng)有以下幾種方法：

（1）選擇合適的樣品前處理方法：兼顧基質(zhì)效應(yīng)和回收率兩方面因素選擇前處理方法，一般來說LLE和SPE等充分進(jìn)化過的樣品ME較小。

（2）改善色譜分離條件：反向色譜分離時，最初流出的主要是基質(zhì)中的極性成分，往往也是引起基質(zhì)效應(yīng)的主要原因，因此改善色譜分離條件，適當(dāng)延長組分的保留時間，有利于減少基質(zhì)響。

（3）優(yōu)化質(zhì)譜條件：基質(zhì)效應(yīng)主要對質(zhì)譜的ESI源有影響，對APCI源影響不大。

（4）選用性質(zhì)相似或同位素內(nèi)標(biāo)：采用內(nèi)標(biāo)法可以抵消ME。但當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)影響很大時，同位素內(nèi)標(biāo)也不能保證待測物和內(nèi)標(biāo)的比值恒定。

（5）采用較低的流速和較小的進(jìn)樣體積：可以使同時離子化的物質(zhì)減少，從而減弱ME。

4.3 LC-MS/MS技術(shù)離子相對豐度要求

LC-MS/MS技術(shù)相對于單純的LC技術(shù)，定性時除了保留時間的要求外，還要求離子相對豐度滿足以下容許偏差要求：

相對豐度（%基峰） EI-GC-MS（相對） CI-GC-MS、GC-MSn、LCMS、LC-MSn（相對）＞50% ±10% ±20%＞20%到50% ±15% ±25%＞10%到20% ±20% ±30%≤10% ±50% ±50%

5 LC-MS/MS在定性定量檢測中的應(yīng)用

定性方法是指用于檢測一種物質(zhì)或一組物質(zhì)在所關(guān)注水平上是否存在的方法。這些方法具有處理高通量樣品的能力，用于大量樣品定性可能的陽性結(jié)果。按照96/23/EC指令的要求，只有方法經(jīng)過驗證并在所關(guān)注的濃度水平上的假陰性率＜5%（β誤差）的方法才可作為定性方法。如有可疑陽性結(jié)果，則要用確認(rèn)方法進(jìn)行確證。

使用LC-MS/MS法的MRM方式采集，對多種類藥物（幾十種上百種）進(jìn)行非靶向檢測，在回收率穩(wěn)定且滿足要求前提下，可直接作為定性方法和定量方法。定性方法要滿足以下條件：空白實驗不出現(xiàn)與陽性對照相同的離子峰；特征離子色譜峰信噪比（S/N）都在3：1以上；試樣色譜峰保留時間應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差為±5%；檢測到的離子對豐度比與校正溶液的一致，容許偏差滿足相關(guān)規(guī)定要求。而定量方法則可以MRM數(shù)據(jù)中響應(yīng)強(qiáng)度最強(qiáng)的離子對作為定量離子對，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。