艽龍膠囊及其主成分對潰瘍性結腸炎小鼠的作用

郭倫鋒 劉尹 郭軍 李瑤 劉鐵明 袁鷹 董明芝 謝艷華 王四旺△

(1.安康市中心醫院藥劑科，陜西 安康 725000；2.空軍軍醫大學口腔醫院B超室，陜西 西安 710032；3.西北大學藥學院，陜西 西安 710069；4.西安正大制藥有限公司，陜西 西安 710043)

艽龍膠囊是由秦艽單味中藥材提取物制備而成的膠囊劑，其內容物為黃色至棕色的顆粒，味苦、微澀；具有清肝泄熱的功效，適用于功能性消化不良屬肝胃郁熱證者，癥見胃脘飽脹、脘部燒灼、口干口苦等病證。本課題組前期研究中，標定了艽龍膠囊HPLC指紋圖譜的23個共有峰，相識度為0.966～0.982，并測定了10批制劑中馬錢苷酸、龍膽苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、山梔苷甲酯、獐芽菜苷、異葒草苷、異牡荊黃素的含量。我們發現艽龍膠囊中龍膽苦苷含量最高(占比達65%以上)，其次為馬錢苷酸(約占15.0%)，再次為6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(約占6.5%)。由此結果可以看出，艽龍膠囊系多化學成分復方制劑，其在體內發揮作用可能具有多靶點效應。潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)系臨床消化科常見、難治性疾病，至今其發病原因尚不明確。由于大腸粘膜慢性炎癥和潰瘍性病變，臨床主要表現出腹痛、腹瀉、里急后重和粘液膿血便等癥狀。雖然UC不是危及生命的疾病，但嚴重影響著人們的身體健康和生活質量，對家庭和社會醫療保障等造成沉重負擔，至今UC尚無專科特效治療藥物。龍膽苦苷具有抗炎鎮痛、清除自由基和治療胰腺炎等藥理作用[3-4]。王海波等證實龍膽苦苷對熱和化學刺激引起的疼痛反應有明顯的鎮痛作用，對急、慢性炎癥反應均有一定的抑制作用。張麗等報道龍膽苦苷可明顯減輕脂多糖致急性肺損傷小鼠肺組織炎癥反應程度，具有較好的抗急性肺損傷作用。基于艽龍膠囊含有65%以上龍膽苦苷，亦未見其對UC預防或治療作用的研究報道，本文探討了艽龍膠囊及其主成分對UC小鼠保護作用，為尋求有效治療UC的藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 動物為SPF級C57/BL6小鼠80只，6～8周齡，體質量18～22 g，雄性，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(軍)2012-0007。動物在獨立換氣籠盒(IVC系統)飼養，溫度22～26 ℃，濕度50%～70%，12 h光照/黑暗周期循環，適應性飼養一周后用于實驗。所需飼料和舒克貝塔SPF級精選刨花墊料購于江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司。藥物為艽龍膠囊(西安正大制藥有限公司提供，批號20170216K)，龍膽苦苷(純度98%，批號201703112，上海純優生物科技有限公司)，馬錢苷酸(純度98%，批號201701201，上海純優生物科技有限公司)，6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(純度98%，批號201802093，上海純優生物科技有限公司)，巴柳氮鈉(湖北百科亨迪藥業有限公司，批號170801)，美沙拉嗪(上海愛的發制藥有限公司，批號170422)。試劑與儀器為葡聚糖硫酸鈉(美國MP，批號Q8758)，惠安易特敏E-termine FOB糞便隱血檢測試劑盒(深圳惠安生物科技有限公司，批號20180111)，NO檢測分析試劑盒(艾美捷科技有限公司，批號K262-200)，小鼠血管活性腸肽ELISA酶聯免疫試劑盒(上海谷研實業有限公司，批號20171223)，小鼠P 物質酶聯免疫分析試劑盒(上海研生實業有限公司，批號20180117)，TNF-α小鼠ELISA檢測試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司，批號HL20044)。Modle型酶聯免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)，5418R低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)，ME235S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 方法 (1)分組與模型制備：將C57/BL6小鼠隨機分為8組，分別為正常對照組、模型組、艽龍膠囊組(62 mg/kg)、龍膽苦苷組(40 mg/kg)、馬錢苷酸組(9 mg/kg)、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(4 mg/kg) 組、巴柳氮鈉組(500 mg/kg)及美沙拉嗪組(900 mg/kg)。采用自由飲用2.5%DSS建立UC小鼠模型，實驗開始后除正常組外，其余組小鼠飲用水均用3%DSS水溶液代替，供小鼠自由飲用(DSS水溶液每天新鮮配置)，造模周期7 d。(2)給藥方法：造模開始同時給予治療藥物，即從第1天開始各組灌胃相應劑量治療藥物，正常組和模型組給予等容量生理鹽水。艽龍膠囊和陽性藥物巴柳氮鈉及美沙拉嗪給藥劑量均根據臨床用量換算(小鼠給藥劑量=人每天用量/70 kg體質量×9.1)，龍膽苦苷、馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷劑量均根據我們測得其艽龍膠囊中的含量確定。(3)檢測指標與方法：①疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分。DAI評分是用于判斷UC的一個重要指標，以小鼠體質量下降程度、大便性狀及血便情況進行綜合評分，評價UC小鼠的發病程度。評分標準為0分：體質量下降0%，大便正常，無隱血；1分：體質量下降1%～5%，大便松散，隱血陽性；2分：體質量下降6%～10%，大便松散，輕微肉眼可見血便；3分：體質量下降11%～15%，稀便，明顯肉眼可見血便。第7天對所有小鼠進行DAI評分。②結腸粘膜損傷指數(colonmucosa damage index，CMDI)評分。第7天給藥結束后，禁食不禁水12h，眼底靜脈叢采血后，分離自肛門2 cm處向上8 cm的結腸，沿腸系膜縱向剖開腸腔，記錄糞便形狀及便血發生情況，用生理鹽水洗凈，吸去水分，稱重；腸粘膜朝上平鋪于玻璃板上，使用放大鏡眼觀，按文獻標準實施CMDI評價，動物結腸大體形態無損傷評為0分；結腸粘膜輕度充血，水腫，表面光滑，無糜爛或潰瘍評為1分；結腸粘膜充血水腫，粘膜粗糙呈顆粒狀，有糜爛或腸粘連評為2分；結腸高度充血水腫，粘膜表面有壞死及潰瘍形成，潰瘍最大縱徑小于1.0 cm，腸壁增厚或表面有壞死及炎癥評為3分；結腸在3分基礎上潰瘍最大縱徑大于1.0 cm 或全腸壁壞死評為4分；同時記錄結腸的潰瘍數及其潰瘍面積。③結腸組織病理學分析。取出10%多聚甲醛固定后的結腸，縱向切取0.2 mm，包埋并切取3～5 μm的蠟片，用hematoxylin-eosin staining(H&E)染色，在200倍顯微鏡下觀察組織病理改變情況，并進行炎癥評分。組織病理學損傷依據之前報道[9-10]進行blinded fashion評分。即：炎癥細胞浸潤程度(0分：無；1分：粘膜層炎細胞浸潤；2分：粘膜層及粘膜下層炎細胞浸潤；3分：炎細胞浸潤至肌層)；隱窩破壞(0分：無；1分：基底1/3隱窩被破壞；2分：基底2/3隱窩被破壞；3分：全部隱窩被破壞)；病變范圍(0分：<1%；1分：1%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%)。④血清及結腸組織中相關指標檢測。采血后，室溫靜置3 h，3 500 rpm離心15 min，分離上層血清，按照試劑盒要求檢測血清中NO含量和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。結腸組織肉眼觀察結束后，分離一部分，稱重，單面刀片切碎轉入組織勻漿器，加1 mL pH7.4 PBS液，勻漿，3500 rpm低溫離心，上清液在-20 ℃保存，按照檢測試劑盒說明檢測血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和小鼠P物質(substance P，SP)含量。

2 結 果

2.1 DAI和CMDI評分 造模第7天，正常組小鼠活動自如，被毛光澤，飲食規律，大便呈顆粒狀，便隱血陰性，體質量呈明顯增加趨勢，結腸粘膜眼觀完整、光滑，皺襞和紋理清晰，無充血、水腫、潰瘍，腸管厚度均勻；模型組小鼠體質量明顯下降，外觀可見精神疲倦，活動減少，毛色無光澤，出現嚴重血便和粘液便，結腸粘膜肉眼見糜爛或壞死，程度不等的腸擴張、腸縮短，腸管增厚、充血、水腫、散在潰瘍和出血及腸粘連，艽龍膠囊、龍膽苦苷、馬錢苷酸及陽性藥物組體質量下降不明顯，精神狀態、被毛色澤、活動程度等均明顯好于模型組動物，結腸粘膜肉眼所見組織形態及腹瀉和隱血病癥等明顯見減輕；6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷組與模型組比較，癥狀有所減輕，但體質量仍呈下降趨勢，且出現明顯血便。見圖1。

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較#P<0.01。

圖1 各試藥對UC小鼠的DAI評分及CMDI評分

2.2 各試藥對UC小鼠組織病理學影響 H&E染色結果表明，正常組小鼠結腸鏡下形態完整，腺體排列整齊，無炎性細胞浸潤；模型組鏡下可見大量炎性細胞浸潤并累及全層，杯狀細胞消失，黏膜損壞嚴重，大部分隱窩損壞；艽龍膠囊、龍膽苦苷、馬錢苷酸及陽性藥物組細胞排列較整齊，組織形態正常，隱窩形態完整，僅有少量炎性細胞浸潤；6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷組黏膜下層仍有較多炎性細胞浸潤，但隱窩損壞程度減小，細胞排列較整齊，炎癥程度有所減輕。見圖2。

圖2 各試藥對UC小鼠結腸組織病理學影響

2.3 各試藥對UC小鼠血清中NO及TNF-α的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清中NO和TNF-α含量顯著升高；與模型組相比，艽龍膠囊、龍膽苦苷、馬錢苷酸及各陽性藥物組血清中NO及TNF-α含量顯著降低；與模型組相比，6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷組血清中NO含量與模型組相比無顯著性差異，TNF-α含量與模型組相比差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較#P<0.01。

圖3 各試藥對UC小鼠血清中NO及TNF-α含量的影響

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較#P<0.01。

圖4 各試藥對UC小鼠結腸中VIP及SP的影響

2.4 各試藥對UC小鼠結腸中VIP及SP的影響 與正常組小鼠相比，模型組小鼠結腸中VIP和SP含量顯著升高；與模型組相比，艽龍膠囊、龍膽苦苷、馬錢苷酸及各陽性藥物組結腸中VIP和SP含量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，而6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷組小鼠結腸中VIP和SP含量與模型組無顯著性差異。

3 討 論

UC的病因至今尚不明確，不少學者認為UC的發病與基因因素、自身免疫和外源物質誘發宿主反應密切相關。血性腹瀉是UC早期最常見的病癥，繼而可出現腹痛、頻繁血便、體質量下降、里急后重、嘔吐或伴發高熱等癥狀，個別病人還可伴發關節炎、虹膜睫狀體炎、肝功能障礙和皮膚病變等。基于Jiang的研究[11]，我國目前UC發病率已增長至0.45/萬。近十余年來，UC的治療雖已取得明顯進展，但其藥物治療主要還是在控制環境、免疫、遺傳和腸道微生態的相互作用的基礎上才具有明顯療效，并非藥物的直接治療作用[12]。

本研究采用成人日用劑量的艽龍膠囊及其主成分占比換算劑量灌胃給予UC小鼠一周，結果顯示艽龍膠囊及其主成分龍膽苦苷和馬錢苷酸能夠顯著改善UC小鼠DAI和CMDI評分，顯著降低UC小鼠血清NO和TNF-α含量，同時還能降低結腸組織SP和VIP含量。由此說明，(1)艽龍膠囊作為主治功能性消化不良的藥物對UC的發生具有顯著的預防作用；(2)艽龍膠囊預防UC的功效成分主要是龍膽苦苷和馬錢苷酸；(3)鑒于龍膽苦苷和馬錢苷酸的總體療效低于艽龍膠囊(無統計學差異)，但其趨勢亦表明艽龍膠囊系多成分的復方發揮著協同作用；(4)基于上述實驗結果，我們推測艽龍膠囊對UC可能也具有很好的治療作用，但有待下一步研究闡明。