溫腎丸對腎陽虛生精障礙大鼠治療作用的藥效學研究

黃小慶 徐云森 吳江平 嚴文兵 高榮芳 郭宇明 招活 蘇勁松

(廣州市中醫醫院泌尿外科，廣東 廣州 510130)

睪丸生精功能障礙是導致男性不育的主要原因，臨床表現為少精、弱精甚至無精。西醫對不育癥的治療一般采用對因對癥治療，如激素替代治療、抗生素治療、精索靜脈曲張及隱睪癥的手術治療等；此外，輔助生殖技術是近年來治療不育癥的熱點，尤其是卵細胞內精子注射(intracytoplasmic spermatozoo injection，ICSI)被認為是男子不育癥治療上的一次革命[1]，但是，其診療費用高，使絕大多數不育患者難以承擔。中醫學對男性不育的認識已有兩千多年的歷史，在治療上具有獨到之處，療效較好，患者易于接受。因此，探求中醫藥治療，從體內改善精子質量，使一部分患者通過簡單經濟而恰當的方法解決生育問題不失為一有效途徑。本研究采用我院臨床應用多年、主治男性不育癥的有效經驗方—溫腎丸，擬通過動物實驗的研究方法，探討其對腎陽虛生精障礙大鼠治療作用的藥效學機制，為挖掘和發揮中醫藥治療優勢病種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物為SD大鼠(成年雄性，SPF級別，體質量180～210 g)，購于南方醫科大學[許可證號：SCXK(粵)20160041]，大鼠飼養及實驗均在清潔級動物實驗室內進行。藥物與試劑：溫腎丸為濃縮水丸，由廣州市中醫醫院制劑室提供(生產批號：粵藥制字Z06022722)；克羅米芬(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號1325021)；腺嘌呤(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號E1814057)； 抑制素B(INHB)、睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為： Y9DTQ7USGC，GGCIBVX15T，PKTV3QZEH2，7DU612VNTK)。儀器：生物組織智能脫水機(湖北安立信醫療實業有限公司，ART-12B)；顯微鏡(OLYMPUS CORPORATION，CKX41SF)；切片機[萊卡顯微系統(上海)有限公司，RM2016]；生物組織攤烤片機(湖北安立信醫療實業有限公司，ATK-7)；生物組織石蠟包埋機(湖北安立信醫療實業有限公司，ABM-6L)；離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司，JW3021H)；酶標儀(杭州奧盛儀器有限公司，AMR-100)。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 60只SD雄性大鼠適應喂養1周，隨機分為空白對照組10只；單純模型組10只；陽性對照組(克羅米芬組)10只；溫腎丸低、中、高劑量組各10只。除空白對照組外 ，其余各組動物按腺嘌呤200 mg/(k g·d)體質量灌胃10 d制備腎陽虛模型。造模結束后開始給藥，實驗組動物按低、中、高劑量組分別給予溫腎丸混懸液50 mg(kg·d)、100 mg(k g·d)、200 mg/(k g·d)體質量灌胃，連續30 d；陽性對照組用克羅米芬混懸液13.5 mg/(kg·d)體質量灌胃，連續30 d。所有動物均予標準飼料喂養，自由飲水。空白對照組和單純模型組灌服等容量生理鹽水，其他條件相同。實驗期間仔細觀察并記錄各組大鼠的表現，如精神體態、毛色情況、活動反應、進食、飲水與大便情況等。大鼠每周稱重1次，以調整給藥劑量。

1.2.2 標本采集及指標檢測 各組大鼠于末次給藥1 h后，采用異氟烷進行麻醉，用眼眶采血法收集血液2～3 mL于抗凝管中，將其編號，靜置1 h后，抽取血液放入離心管中離心，轉速為3 000 rpm，5 min，留取血清按說明書進行操作檢測血清T、FSH、LH、INHB含量，酶標儀檢測460 nm的OD值。同時獲取雙側睪丸，將睪丸樣本置于固定液中固定10～12 h。固定后的樣本經常規梯度酒精(80%、90%、100%)脫水，二甲苯I(無水乙醇∶二甲苯=1∶1 )浸泡2h后二甲苯Ⅱ和Ⅲ分別處理10 min、5 min進行透明。將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋，冷卻凝固成塊。連續切成厚度5 μm的薄片，每隔30張取蠟帶放到加熱的水中燙平，分別貼于涂有蛋白甘油(用于HE染色)的載玻片上，置于45 ℃恒溫箱中烘干備用。石蠟切片HE染色進行病理組織學觀察及Johnson評分。

2 結 果

2.1 各組一般情況觀察 空白組，發育較快，對外界刺激反應靈敏、活動正常，毛發光滑澤潤。模型組大鼠喜暖怕冷、倦縮拱背、毛無光澤且散亂、精神萎靡、反應遲鈍，形體消瘦，生長緩慢。溫腎丸各劑量組和克羅米芬組造模10 d后開始干預，隨著實驗的進行，與單純模型組比較上述癥狀逐漸減輕，給藥30 d后，溫腎丸組一般狀態改善較為明顯。除模型組大鼠死亡2只外，其余各組均無死亡。

2.2 睪丸組織病理觀察及 Johnsen評分 各組病理活檢顯示，空白組(圖A)大鼠生精小管基膜完整，輪廓清晰，生精細胞層次豐富，管腔處有大量精子細胞，間質細胞分布均勻；模型組(圖B)大鼠生精小管基膜塌陷，變性，生精細胞層次模糊不清，排列稀疏，大量細胞脫落與細胞碎片擁堵管腔，管腔內精子細胞缺失，間質細胞聚集成團；克羅米芬組(圖C)大鼠生精小管基膜欠完整，生精細胞層次模糊不清晰，管腔生精細胞稀疏，間質細胞聚集分布；溫腎丸低劑量組(圖D)大鼠生精小管基膜欠完整，生精細胞排列稀疏，管腔內精子數量較少，間質細胞聚集分布；溫腎丸中、高劑量組(圖E、圖F)大鼠生精小管基膜較完整，輪廓較清晰，生精細胞層次較多，管腔內精子細胞較多，間質細胞散在分布。各組大鼠睪丸活檢Johnson 評分比較見表1。

A：空白組；B模型組；C克羅米芬組；D溫腎丸低劑量組；E溫腎丸中劑量組；F溫腎丸高劑量組

圖1 各組大鼠高倍鏡下生精小管形態

表1 各組大鼠睪丸活檢Johnson 評分比較

注：與模型組相比，*P<0.01，與溫腎丸低劑量組、克羅米芬對照組相比，△P<0.01。

2.3 各組大鼠血清T、FSH、LH、INHB含量比較 模型組各項相關指標均有變化，其中T和INHB減少，FSH、LH升高，與其他組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。溫腎丸各劑量組和克羅米芬組治療后大鼠血清T、INHB上升，FSH、LH降低，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)；其中溫腎丸高、中劑量組與低劑量組和克羅米芬組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清T、FSH、LH、INHB比較含量

注：與模型組相比，*P<0.01，與溫腎丸低劑量組、克羅米芬組相比，△P<0.01。

3 討 論

男性不育癥中醫統屬 “精少無子”、“精清”、“精冷”等范疇，中醫認為腎藏精主生長發育與生殖，本病主要責之于腎，若腎陽虛損，溫煦生化功能失職，或腎陰不足，精氣化生乏源以及虛火內灼津液，可導致精少清冷，精弱無力而造成不育。雖然不育癥的病因病機變化多端，治療方法多種多樣，但“補腎”仍是中醫藥治療男性不育的重要方法。

腎陽虛所致的男性不育在中醫男科的研究中一直是備受重視的課題。腎陽虛作為中醫學的概念，是指腎陽為一身陽氣之根本，它對體內各個臟腑起著溫煦生化的作用，若腎陽虛損，溫煦功能失職，則可導致虛寒衰弱諸癥及生殖機能的減退。

腎陽虛模型的制作方法較多，有糖皮質激素注射法、腺嘌呤灌喂法、 鎖陽水灌注法等。糖皮質激素造模是應用較廣泛的造模方法，該模型主要通過影響下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸功能，導致動物對外界環境變化的應激適應能力下降，動物的生命活動減弱、畏寒喜暖等表現與腎陽虛的表現一致[2]，但此法對性腺軸的影響不明顯。縱觀國內外文獻，有關研究睪丸性不育動物的模型實驗有多種，就實際操作方面而言，以腺嘌呤模型的效果最為理想。高濃度的腺嘌呤代謝產物可以直接毒害腎臟和睪丸的生殖細胞、間質細胞，鏡檢腎組織呈萎縮傾向，結締組織增生，睪丸組織萎縮，大部分生精小管退行性變化，精子產生減少或缺損等病理改變可作為腎陽虛證的客觀指標[3-4]。有研究報道，從“腎主生殖”角度評價腺嘌呤與氫化可的松誘導的腎陽虛模型，認為腺嘌呤誘導的腎陽虛證SD大鼠模型在形態學與性腺指標方面更符合中醫腎陽虛形態學表現[5]。本研究造模結果證實，模型大鼠從腺嘌呤灌喂開始逐漸出現喜暖怕冷、倦縮拱背、毛無光澤散亂、精神萎靡、反應遲鈍，形體消瘦，生長緩慢等“腎陽虛”表現；模型大鼠睪丸病理組織學觀察所見，大鼠生精小管受損明顯。實驗結果顯示，溫腎丸干預后可改善造模大鼠的腎陽虛證現象，有效緩解大鼠睪丸生精小管和生精細胞的損傷，提高生精障礙大鼠睪丸病理組織Johnson評分。

性激素FSH、LH、T的變化與生精功能狀態有著密切的關系，睪丸的支持細胞與生精細胞共同構成睪丸的曲細精管，為精子發生提供獨特的微環境。睪丸生精功能主要受下丘腦—垂體—睪丸軸調控，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)作用于腦垂體，使其合成和分泌卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)。精子發生是FSH作用于支持細胞與LH通過刺激間質細胞分泌睪酮(T)相互協同作用的結果[6-7]。以往的實驗研究已證實，腎陽虛證存在著下丘腦—垂體—性腺軸不同環節、不同程度的功能紊亂；補腎中藥能夠通過減輕性腺激素細胞超微結構的損傷，改善下丘腦—垂體—性腺軸的功能而治療不育[8-12]。本研究結果顯示，溫腎丸干預后大鼠血清T水平上升，FSH下降，表明溫腎丸能夠調節模型大鼠的性激素水平，使受損的生精功能得到不同程度改善。此外， FSH在生精過程中除直接啟動精原細胞的分裂和早期生精細胞發育外，還促使支持細胞分泌抑制素B(inhibinB，INHB)，INHB被認為是反映支持細胞功能的血清標記物，其能夠選擇性地抑制腦垂體合成和分泌FSH，還可以阻斷下丘腦刺激引起的垂體FSH釋放，對FSH的分泌發揮著極強的負反饋調節作用[13]。相關研究報道，當睪丸生精功能受損時，血清 INHB 水平下降；INHB血清水平與精子密度、精子總數呈顯著正相關，與血清FSH呈顯著負相關[14]。Pierik等[15]應用睪丸活檢評分(Johnsen評分)評價FSH、INHB對精子發生正常或障礙的準確性，認為INHB的相關系數較FSH的相關系數有統計學意義。在本研究中，溫腎丸中、高劑量組大鼠血清 INHB水平均高于模型對照組和陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，結果與上述文獻報道相符。

本研究結果表明，通過溫腎丸治療后模型大鼠腎陽虛癥狀得到明顯改善，而且能有效調節紊亂的性激素水平及上調INHB水平；睪丸病理觀察及Johnsen評分提示受損的大鼠睪丸生精功能得到較好的緩解和修復，從而為溫腎丸在臨床治療腎陽虛型男性不育提供可靠的實驗依據。