宮頸癌放化療患者DNA-PKcs表達及其預后關系研究

王旭杰 蔡蓓珺

(上海市長寧區婦幼保健院婦科，上海 200051)

宮頸癌為目前最常見的女性惡性腫瘤之一，DNA依賴性蛋白激酶(DNA-depended protein kinase，DNA-PK)作為DNA靶向性和調節性成分，在DNA修復中發揮重要的作用，高表達意味著修復能力的提高[1-3]。國外關于DNA-PK在放化療宮頸癌患者中的表達已有報道，但國內這方面資料尚少，且關于DNA-PKcs表達與預后關系尚不清楚[4-5]。本研究觀察了DNA-PKcs蛋白在放化療宮頸癌患者中的表達，及其與生存相關，為提高宮頸癌放化療的敏感性提供新途徑。報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年1月至2013年7月我科治療的Ⅱb～Ⅲb期宮頸癌患者109例，年齡23～75歲，平均(45.6±9.73)歲。入選標準：明確診斷為Ⅱb～Ⅲb期宮頸癌；均未經過其他化療藥物治療；檢查肝腎功能、肺功能、心電圖均正常，無化療禁忌；能配合治療，無藥物過敏史者。排除標準：(1)合并其他組織器官腫瘤者；(2)不配合治療者，隨訪資料缺失者；(3)伴有嚴重的神經和精神障礙的患者。患者腫瘤特征，如分期、腫瘤大小、病理組織學類型和分級與RT后腫瘤緩解程度見表1。本文經我院倫理委員會批準，患者或患者家屬均簽署了知情同意書。

表1 與腫瘤緩解相關的腫瘤特征

1.2 治療方法 體外照射野采用6-MVX線直線加速器，全骨盆外照射(EBRT)和低劑量率或高劑量率聯合使用。前后對穿照射，每周5次，每次1野，每野盆腔中平面劑量(DT)2Gy。當達到DT30Gy時改為盆腔四野照射，于全盆照射中央擋鉛(4～5) cm×(10～11) cm，每次每野DT 2Gy，每周5次，總量DT 20Gy。大野10次后同時給予192銥腔內后裝治療，每次A點6Gy，每周1～2次，共7次，A點總量42Gy。同步采用經股動脈穿刺雙側髂內動脈灌注化療，藥物選擇順鉑、環磷酰胺、阿霉素或5-Fu，二聯或三聯用藥。根據臨床療效及檢查結果選擇1～4個療程的動脈灌注化療，療程間隔3周，每個療程結束后2周評估介入療效，符合下列情況且具備手術條件者行根治性手術：(1)宮頸基本光滑或宮頸腫瘤縮小2/3，臨床分期出現逆轉；(2)宮旁組織變松軟有彈性；(3)無嚴重的介入化療損傷。此時可行廣泛子宮切除+盆腔淋巴結清掃術。放化療敏感性的評估由手術切除的標本1周內組織病理學進行評價。免疫組化檢測DNA-PK蛋白表達及結果判斷：采用免疫組織化學法檢測標本中的DNA-PK表達，標本經福爾馬林固定后液體石蠟包埋，制成4μm厚度連續切片。先行梯度酒精脫水，然后采用PBS緩沖液沖洗，加入生物學一抗過夜，山羊血清封閉后加人生物學二抗，DAB顯色。梯度酒精水化后采用蘇木精復染，再以中性樹膠封片。SP-9002免疫組化試劑盒與PBS緩沖液均購自廣州安必平醫藥科技公司，檢驗醫師嚴格遵照說明書操作。DNA-PK以細胞核出現黃色或棕黃色顆粒為陽性，同時隨機選取每張切片10個400倍視野，并綜合染色強度以及陽性細胞所占比例進行判定[5]，染色強度評分：0分為不著色，1分為黃色，2分為棕黃色，3分為黃褐色。陽性細胞占比評分[6]：0分為陽性細胞占比<5%，1分為陽性細胞占比在5%～24%之間，2分為陽性細胞占比在25%～49%之間，3分為陽性細胞占比在50%～74%之間，4分為陽性細胞占比>75%。染色強度評分×陽性細胞占比評分即為綜合評分，其中0分記為陰性，1～12分記為陽性。隨訪：患者均自電話或門診隨訪，術后隨訪5年，失訪人群在生存分析前刪除。

2 結 果

2.1 兩組標本中DNA-PK陽性率表達 DNA-PK蛋白主要位于細胞核，在正常宮頸組織中表達呈陰性，宮頸癌周圍淋巴結組織中呈淡黃色或黃色陽性(++)表達，低分化腺癌組織、鱗狀細胞癌癌組織中呈棕褐色強陽性表達(+++)。見圖1。pCR組的DNA-PK陽性率(56/85，65.8%)低于non-pCR組(18/24，75.0%)，差異有統計學意義(χ2=8.06，P=0.04)。見表1。

表2 pCR組及non-pCR組DNA-PK蛋白陽性表達率比較(n，%)

注：A DNA-PK在正常宮頸組織中不表達；B DNA-PK在宮頸癌周圍淋巴結中弱表達；C DNA-PK在低分化腺癌組織中高表達；D DNA-PK在鱗狀細胞癌組織中高表達。

圖1 DNA-PK在宮頸癌及正常組織中的表達情況

2.2 DNA-PK的表達與宮頸癌患者預后的關系 109例宮頸癌患者均自電話或門診隨訪，術后隨訪5年，隨訪截至日期為2018年8月3日，109例患者中，105例完成隨訪，2例DNA-PK蛋白表達陽性患者失訪，失訪率為1.8%(2/109)，失訪人群在生存分析前刪除。隨著DNA-PK表達水平增加，患者中位生存時間逐漸縮短，DNA-PK表達水平不同的三組患者1、3 和 5 年生存率比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。采用 Cox比例回歸風險模型對103例宮頸癌患者的5年生存影響因素進行分析， 結果顯示：DNA-PK 蛋白(+++)表達(P=0.002)、分化程度越低(P=0.036)、浸潤深度越高(P=0.001)和有遠處轉移(P=0.002)是宮頸癌患者的獨立危險因素。見表4。

表3 不同水平DNA-PK表達的宮頸癌患者中位生存時間和生存率

表4 影響宮頸癌患者5年生存結局的COX模型多因素分析

注：總χ2=47.20，ν=5，P<0.001。

3 討 論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，呈逐年上升趨勢。電離輻射可以損傷腫瘤細胞DNA，殺死細胞，而腫瘤細胞對電離輻射的敏感性取決于DNA雙鏈斷裂(DSBS)修復。非同源末端連接(NHEJ)是哺乳動物細胞DNA DSBS修復的主要途徑[7]。DNA-PK在NHEJ過程中發揮至關重要的作用。DNA-PK由一個催化亞基DNA-PKcs(大小470 kD)和2個調節亞基Ku70、Ku80組成[8]。DNA-PKC為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇-3激酶相關激酶家族，包括其他涉及DNA修復信號的蛋白，如ATM和ATR[9]。ATM中的基因突變DNA PKC基因導致免疫缺陷、癌癥易感性對電離輻射具有超敏反應。目前，人腫瘤細胞系膠質母細胞，肺癌細胞系細胞中DNA PKC含量與輻射敏感性的相關性已經得到證實[10]。另外學者研究了I b～Ⅱa期子宮頸癌組織中DNA損傷反應蛋白與腫瘤放療敏感性的關系，發現腫瘤組織中DNA-PKcs、Ku86、Ku70表達明顯高于相鄰的非瘤組織，而且三者密切相關；但結論是DNA-PK各亞基在瘤組織中的表達水平不能作為早期宮頸癌放射敏感性的預測指標[11]。研究[12]發現，DNA-PKcs在肺癌、食管癌、大腸癌等多種腫瘤組織中高表達，且可以降低腫瘤的放療敏感度。有研究用免疫組化法檢測DNA-PKcs蛋白在治療前I B～ⅡB期宮頸癌組織中的表達，發現DNA-PKcs在放療敏感組32例中僅有7例高表達，放療抗拒組31例中有30例高表達，DNA-PKcs高表達組總生存時間均數比低表達組短[13]。本研究結果顯示，病理緩解宮頸癌中的DNA-PK陽性率低于病理無緩解宮頸癌，差異具有統計學意義。提示DNA-PKcs的低表達是宮頸癌對放化療敏感的一項參考指標。因為放射線是通過損傷細胞DNA導致細胞壞死凋亡而殺死腫瘤細胞，而抗腫瘤藥物是在腫瘤細胞增值周期中破壞或抑制DNA的合成而殺滅腫瘤細胞。如果腫瘤細胞DNA修復基因過度表達，腫瘤細胞可能快速修復，從而對放療和化療產生耐受，使治療難以奏效。因此，在治療之前，檢測患者宮頸癌組織中DNA-PKcs的表達水平，可以較好地預測宮頸癌的放化療敏感性，對臨床治療方案的選擇有著重要的指導意義。DNA-PK與宮頸癌的遠處轉移、浸潤有關，可作為宮頸癌發生、發展及轉移的預測因子。DNA-PK蛋白(+++)表達死亡風險更大，5年生存率及中位生存時間更低。因此推測，DNA-PK蛋白的高表達可能反映了宮頸癌患者的不良預后結局。采用 Cox比例回歸風險模型對103例宮頸癌患者的5年生存影響因素進行分析，結果顯示：DNA-PK 蛋白(+++)表達(P=0.002)、分化程度越低(P=0.036)、浸潤深度越高(P=0.001)和有遠處轉移(P=0.002)是宮頸癌患者的獨立危險因素。這些均提示宮頸癌組織中的DNA-PK表達與宮頸癌預后有關，可能成為檢測宮頸癌患者病情以及評估宮頸癌患者預后的重要指標。

總之，DNA-PK在宮頸癌組織中高表達可能與放化療抵抗、預后有關，但其機制尚需要更進一步的探討，阻斷DNA-PK信號傳導通路有可能成為增加放化療敏感性的方法。