四種常見離體脫位牙貯存介質對其牙周膜成纖維細胞生物活性的影響

許厚義　戴群　陳橋秀

【摘要】 目的：評價比較四種常見離體脫位牙貯存介質對牙周膜成纖維細胞活性的影響。方法：選取2017年1月-2018年1月本院口腔臨床14～22歲青少年200例因正畸需要拔除的下頜第一前磨牙200顆作為研究對象，將其隨機分為四組試驗組（生理鹽水組、牛奶組、唾液組、自來水組）和對照組，各40顆。培養脫位牙中的牙周膜成纖維細胞，其中試驗分別采用生理鹽水、牛奶、唾液、自來水作為貯存介質，對照組則直接在空氣中保存。采用CCK-8法分別檢測牙周膜細胞在四種常見離體脫位牙貯存介質中2、6、12、24 h不同時間點的活性，并與對照組進行比較。結果：各試驗組不同時間點的牙周膜細胞存活率均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。生理鹽水、牛奶及唾液組不同時間點的牙周膜細胞存活率均明顯高于自來水組，差異均有統計學意義（P<0.05）。牛奶、唾液組不同時間點的牙周膜細胞存活率均明顯高于生理鹽水，且牛奶組12、24 h的牙周膜細胞存活率均明顯高于唾液組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：牛奶、唾液貯存的牙周膜成纖維細胞活性較高，可作為有效的離體脫位牙臨時貯存液，而生理鹽水的保存效果次之，而自來水保存效果最差，不適合作為貯存介質。

【關鍵詞】 牙周膜成纖維細胞; 脫位牙; 貯存介質; 生物學活性

【Abstract】 Objective：To evaluate the effect of four common in vitro dislocated teeth storage medium on the biological activity of periodontal ligament fibroblasts.Method：A total of 200 mandibular first premolars extracted from 200 cases of 14-22 year old adolescents in our hospital due to orthodontic treatment from January 2017 to January 2018 were selected as the research objects.They were randomly divided into four experimental groups（saline group，milk group，saliva group，tap water group）and control group，40 teeth in each group.The periodontal ligament fibroblasts were cultured in the dislocation teeth.The experimental group were treated with saline，milk，saliva and tap water as storage medium respectively，while the control group was stored directly in air.The periodontal ligament cells were detected by CCK-8 method in the storage medium of four common in vitro dislocation teeth for 2，6，12 and 24 h respectively.The activity at different time points were compared with the control group.Result：The survival rate of periodontal ligament cells in each experimental group at different time points were significantly higher than those in the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The survival rate of periodontal ligament cells in the saline，milk and saliva groups at different time points were significantly higher than those in the tap water group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The survival rate of periodontal ligament cells in the milk and saliva groups at different time points were significantly higher than those in the saline group，and the survival rate of periodontal ligament cells in the milk group at 12 and 24 h was significantly higher than that in the saliva group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The periodontal ligament fibroblasts stored in milk and saliva have higher activity and can be used as effective temporary storage solution for dislocated teeth in vitro.The storage effect of saline is the second，while that of tap water is the worst，and it is not suitable for storage medium.

【Key words】 Periodontal ligament fibroblasts; Dislocated teeth; Storage medium; Biological activity

First-authors address：Affiliated Stomatological Hospital of Nanchang University，Key Laboratory of Stomatology and Biomedicine of Jiangxi Province，Nanchang 330006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.03.007

由于交通事故、突發事件等外力作用導致前牙外傷是口腔科常見的疾病。據數據統計，目前在世界范圍內恒牙外傷的發生率已達10%～35%，其中牙脫位約占前牙外傷的0.5%～3.0%[1]。牙周膜細胞包括成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質細胞等，它們具有牙周組織再生和修復的作用，其中牙周膜成纖維細胞是脫位牙再生存的關鍵。牙脫位再植后，周圍可分裂的細胞將會吸收已破壞的牙周組織，受損較輕區域斷裂的牙周膜纖維可進行功能性重建。因此盡量維持脫位牙牙周膜細胞的生物學活性對于保障脫位牙的再植成功率具有關鍵意義。但牙外傷意外發生時，外傷因素使牙齒完全脫離了牙槽窩，牙齒的牙周膜分為兩部分，一部分緊貼在牙槽窩骨壁上，體內的良好環境和營養物質使其能夠存活，而另一部分緊貼于脫位牙的牙根表面，體外干燥的環境中無法提供牙周膜細胞生長必需的營養物質。而脫位牙往往無法進行即刻再植，而脫位牙牙根表面牙周膜細胞如果長期處在干燥的環境中會因為缺乏細胞生長必需的營養物質而發生失活，需要將脫位牙及時、有效地浸泡保存在一個濕潤、生理性平衡的介質中，以維持牙周膜細胞的生物學活性[2-3]。因此篩選常見易獲取且有效的離體脫位牙貯存介質對于牙再植研究的成功具有重要意義[4-5]。目前生理鹽水、牛奶、自來水、唾液、細胞培養基、椰奶及蜂蜜等是臨床研究常用的各種脫位牙保存液[6-7]。由于生理鹽水、牛奶、自來水、唾液這四種貯存介質在生活中最為常見，也容易獲得，本次研究對這四種常見離體脫位牙貯存介質對牙周膜成纖維細胞活性的影響進行了比較，以為臨床選擇最恰當脫位牙保存處理方法提供參考依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集 選取2017年1月-2018年1月本院口腔臨床上14～22歲青少年200例因正畸需要拔除的下頜第一前磨牙200顆作為研究對象，納入標準：牙齒均發育正常;均無齲壞;X線片下牙周膜均無異常;口腔條件良好。排除標準：存在全身系統性疾病及近12周內有服用抗生素、免疫抑制劑。其中男109例（109顆），女91例（91顆），平均年齡（17.8±3.4）歲。將其隨機分為四組試驗組（生理鹽水組、牛奶組、唾液組、自來水組）和對照組，各40顆。所有患者均知曉本次研究并簽署知情同意書，該研究已經醫院倫理學委員會批準通過。

1.2 儀器與材料 Heraeus GBB-16型CO2紫外清潔型培養箱、Olympus公司的IX51型倒置顯微鏡、Leica公司的RM2235型石蠟切片機、Eppendorf 5430R型離心機、美國Bio-Tek公司的酶聯免疫檢測儀、Costar公司的96孔培養板及培養瓶、日本同仁化學研究所的CCK-8試劑。生理鹽水由上海長富提供（pH=7.0）、牛奶為上海光明牌的光明優（pH=6.7）、自來水（pH=7.5）和唾液（pH 6.6～7.1）。

1.3 方法

1.3.1 牙周膜成纖維細胞的培養 刮下脫位牙牙根中1/3部位的牙周膜組織，剪成小塊，加入離心管中，采用全牙酶消化30 min，將經過消化的細胞過濾離心后棄去上清液，種植于25 mL培養瓶底，加入含10%胎牛血清（FCS）、鏈霉素[生產廠家：華北制藥股份有限公司，國藥準字：H13023985，規格：1 g（100萬單位）]，用量為100 ?g/mL以及青霉素[生產廠家：重慶藥友制藥有限責任公司，國藥準字：H50020765，規格：0.48 g（80萬單位）]，用量為100 ?g/mL的DMEM培養液，在CO2孵箱中進行培養，培養條件為37 ℃、5% CO2。6 h后翻轉培養瓶繼續培養。每2 d更換一次培養液。觀察細胞生長達匯合點后即長滿瓶低的70%～80%時，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化進行傳代，傳代比例1︰2，取第8代細胞用于實驗。

1.3.2 牙周膜成纖維細胞活性的檢測 選取生長良好的第8代人牙周膜細胞常規消化后，調整細胞濃度為8×103/mL，分別取100 ?L接種于4個96孔板內。在原培養液中培養24 h后棄去培養液，采用PBS溶液反復沖洗3遍吸干，然后分別加入不同的保存液150 ?L作為試驗組：生理鹽水、牛奶、唾液、自來水組，對照組則不加任何液體，直接在空氣中保存。4個96孔板內分別在培養箱中放置2、6、12、24 h，培養條件：5% CO2，37 ℃。然后棄去保存液，采用PBS溶液反復沖洗3次，分別加入100 ?L的含有10% CCK-8檢測試劑的DMEM培養基，繼續培養2 h后，使用酶聯免疫檢測儀測定波長450 nm處的光吸收值（OD）。分析牙周膜細胞在生理鹽水、牛奶、唾液、自來水四種離體脫位牙貯存介質中2、6、12、24 h不同時間點的存活率，并與對照組進行比較。為減少人為誤差，各組在不同保存時間下的離體牙平均由兩名實驗人員按同一標準獨立完成檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般資料比較 生理鹽水組中男23例（23顆），女17例（17顆）;平均年齡（17.6±3.3）歲。牛奶組中男22例（22顆），女18例（18顆）;平均年齡（17.7±3.5）歲。唾液組中男21例（21顆），女19例（19顆）;平均年齡（17.8±3.5）歲。自來水組中男22例（22顆），女18例（18顆）;平均年齡（17.9±3.6）歲。對照組中男21例（21顆），女19例（19顆）;平均年齡（17.9±3.7）歲。各組的性別、年齡一般資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 各組不同時間點牙周膜細胞存活情況比較 各試驗組不同時間點的牙周膜細胞存活率均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。生理鹽水、牛奶及唾液組不同時間點的牙周膜細胞存活率均明顯高于自來水組，差異均有統計學意義（P<0.05）。牛奶、唾液組不同時間點的牙周膜細胞存活率均明顯高于生理鹽水組，且牛奶組12、24 h的牙周膜細胞存活率均明顯高于唾液組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

脫位牙的牙周膜細胞在體外干燥的環境中會迅速失活并凋亡，而牙周膜細胞失活后的脫位牙在進行再植后，成功率將大大降低[8-9]。且研究發現隨著脫位牙在干燥環境時間的延長，脫位牙再植后成功率也隨之下降，因此需要將脫位牙盡快保存于生理性平衡介質中[10-11]。通過保存液的浸泡處理，既能提供牙周膜細胞生長所必需的營養，還能去除牙根表面的污染物及已死亡的牙周膜細胞，使部分牙周膜細胞恢復活性，從而保障再植術的成功率。

國內外學者針對牙離體脫位時的貯存溶液、環境溫度、濕度，以及脫位貯存時間等進行了大量研究。實驗數據表明，Hank平衡鹽溶液，DMEM高糖培養基，含10% FCS的DMEM培養液等保存介質對于維持牙周膜細胞活性都有非常理想的效果[6，12]，但是這些材料在生活中并不常見，甚至很多普通人也許是聞所未聞，更無法在短時間內無法獲得。因此目前臨床公認的理想的保存介質應符合以下條件：（1）具有較為適宜的生理滲透性;（2）很少有細菌成分;（3）室溫下能保存牙周膜細胞活性較長時間;（4）在事發現場或附近容易獲得[13]。生理鹽水、牛奶、自來水、唾液均是生活中常見且容易獲得的貯存介質。牛奶具有較適宜的生理滲透性和pH值，其中很少有細菌成分，且含有細胞生長所需的維生素、氨基酸等營養物質，作為脫位牙的貯存劑能較好地維持牙周膜細胞活性避免其進一步凋亡[14]。有研究發現，與常溫牛奶相比，低溫（4 ℃）牛奶保離體牙的效果更佳，低溫能減輕牙周膜細胞的消耗和腫脹，有利于保護牙周膜細胞[15]。唾液作為貯存介質，能保持牙周膜細胞原有的生態環境，從而發揮較好的貯存效果，牙體脫位后可直接將其含在口中浸泡于唾液中[16-17]。不過由于唾液中含有較多的細菌，不適宜進行脫位牙的長時間貯存。生理鹽水的生理滲透性和pH值與牙周膜細胞相近，但是其中沒有細胞生長所必須的營養物質，因此短時間內保持牙周膜細胞的活性，建議生理鹽水的保存時間不宜超過2 h[18]。而自來水的pH值偏高，而滲透壓遠低于牙周膜細胞，容易導致牙周膜細胞迅速裂解而失活，因此保存脫位牙的牙周膜成纖維細胞時效果比較差，不建議作為首選保存液[4，19]。

本次研究對生活中常見的生理鹽水、牛奶、自來水、唾液這四種貯存介質對脫位牙牙周膜細胞活性的影響進行比較發現，各試驗組不同時間點的牙周膜細胞存活率均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。生理鹽水、牛奶及唾液組不同時間點的牙周膜細胞存活率均明顯高于自來水組，差異均有統計學意義（P<0.05）。牛奶、唾液組不同時間點的牙周膜細胞存活率均明顯高于生理鹽水組，差異均有統計學意義（P<0.05）;且牛奶組12、24 h的牙周膜細胞存活率均明顯高于唾液組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結果提示牛奶和唾液可作為脫位牙的良好貯存劑，且牛奶長效貯存效果更好。而生理鹽水可作為短效貯存劑，而自來水的貯存效果較差，不適合作為貯存介質。

綜上所述，牛奶、唾液貯存的牙周膜成纖維細胞活性較高，可作為有效的離體脫位牙臨時貯存液，而0.9%生理鹽水的保存效果次之，而自來水保存效果最差，不適合作為貯存介質。

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（收稿日期：2018-06-19） （本文編輯：李瑩瑩）