Toll樣受體在不同轉移能力人乳腺癌細胞株中的差異表達及意義研究

趙毅玲 姚麗紅 李彩娟 單叔煤 奚克敏 孫迎燕

[摘要] 目的 探討Toll樣受體在不同轉移能力人乳腺癌細胞株中的差異表達及意義。 方法 分別選取高轉移能力人乳腺癌細胞株MDA-MB231與低轉移能力人乳腺癌細胞株MCF-7，采用RT-PCR、實時熒光定量PCR及細胞免疫熒光檢測測定其蛋白水平及TLR1-TLR10mRNA水平，比較兩株細胞TLRs表達情況及差異性。 結果 人乳腺癌細胞株MCF-7mRNA、MDA-MB-231 mRNA、蛋白水平均存在TLRs廣泛表達;兩種細胞株TLR4、TLR6、TLR8及TLR9 mRNA水平表達存在明顯的差異性（P<0.05）;MDA-MB-231的TLR4、TLR6、TLR7及TLR5水平明顯高于MCF-7（P<0.05）。 結論 TLRs在不同轉移能力人乳腺癌細胞株中表達廣泛但水平存在差異，其中TLR4受體差異表現最為明顯，考慮TLRs表達差異與乳腺癌細胞轉移能力相關。

[關鍵詞] Toll樣受體;不同轉移能力;人乳腺癌細胞株

[中圖分類號] R979.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）17-0032-04

[Abstract] Objective To investigate the differential expression and significance of Toll-like receptors in human breast cancer cell lines with different metastatic ability. Methods High-metastatic human breast cancer cell line MDA-MB231 and low metastatic human breast cancer cell line MCF-7 were selected， and their protein levels and TLR1-TLR10 mRNA level were determined by RT-PCR， real-time fluorescent quantitative PCR and cellular immunofluorescence assay.The expression and difference of TLRs in the two cells was compared. Results The expression of TLRs was widely expressed in human breast cancer cell line MCF-7 mRNA and MDA-MB-231 mRNA and protein expressions. There are significant differences in the expression of TLR4， TLR6， TLR8 and TLR9 mRNA levels in the two cell lines（P<0.05）. The levels of TLR4， TLR6， TLR7 and TLR5 in MDA-MB-231 are significantly higher than those in MCF-7 （P<0.05）. Conclusion TLRs are widely expressed in different metastatic human breast cancer cell lines， while the expression levels are different. The difference of TLR4 receptors is the most obvious， considering that the difference of TLRs expression is related to breast cancer cell metastasis ability.

[Key words] Toll-like receptor; Different metastatic ability; Human breast cancer cell line

近年來分子水平的研究為乳腺癌的診治帶來了新的方向和希望，相關分子標志物表達的檢測有助于了解惡性程度和判斷預后，繼而通過合理治療以達到控制腫瘤的目的[1]，進而實現對后天免疫系統的調整。最新研究證實，TLRs在多種腫瘤細胞中均有廣泛表達[2]，但目前還鮮有關于其在乳腺癌中的表達研究。本研究擬采用超聲彈性成像技術、免疫組織化學染色方法、實時定量PCR技術對乳腺癌患者患病部位進行超聲彈性成像評價，對腫瘤組織中Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）的表達情況進行檢測，并將TLRs表達與超聲彈性成像（UE）特征進行比較，探討二者之間的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑? Trizol試劑由北京奧維亞生物技術有限公司提供;逆轉錄試劑由北京億鳴聯創生物科技有限公司提供;PCR反應試劑由上海諾晶生物科技有限公司提供，TLR1～TLR10以及GAPDH引物由上海生工合成;DMEM培養基由北京索萊寶科技有限公司提供;新生牛血清購自上海遠慕生物科技有限公司;TLR兔抗人多克隆抗體由上海萬疆生物技術有限公司提供。

1.1.2 儀器? Alpha-1900Plus紫外分光光度儀購自上海譜元儀器有限公司;CAS IR GRID聚合酶鏈反應儀由蘇州東勝興業科學儀器有限公司提供，HI VISION Ascendus超聲診斷儀日本日立公司;Philips iu Elite超聲診斷儀荷蘭飛利浦公司。Toshiba Aplio XG 超聲診斷儀日本東芝公司;ABI-7000熒光定量PCR儀，美國ABI公司;LightCycler 480 II熒光定量PCR儀瑞士羅氏公司;Easypure uv/uf超純水制造儀美國BARNSTEAD公司;i Cycler PCR 擴增儀由美國BIO-RAD公司提供;凝膠圖像分析系統（UVPGDS-8000）由美國 BIO-RAD 公司提供;穩壓穩流電泳儀（DYY-6B）由六一儀器廠（北京）提供;可調微量加樣器（Eppendprf）由德國Eppendprf公司提供。

1.2 標本收集

研究數據采集期間收集牡丹江醫學院紅旗醫院乳腺癌患者100例，均獲得最終手術病理結果，術前行常規超聲檢查，記錄病灶的大小（縱橫比）、形狀是否規則、邊界是否清晰、內部有無小鈣化、后方伴或不伴回聲衰減等特點。研究時間為2016年12月～2017年12月，確保樣本的保存空間和溫度，避免受其他不良因素對樣本的影響。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養? MDA-MB-231、MCF-7細胞株均購自上海中國科學院細胞庫。采用10%胎牛血清RPMI 1640細胞培養液對MDA-MB-231進行培養，采用10%胎牛血清及0.01 g/L牛胰島素的DMEM細胞培養液對MCF-7進行培養，在容量為50 mL培養瓶中接種，溫度設置為37℃，CO2濃度為5%，培養48 h后更換培養液，待其進入對數生長周期予以收獲。

1.3.2 總RNA提取及逆轉錄? 在1 mL Trizol中添加2.0×106個細胞，經過分層、沉淀及洗滌后，半干后采用0.1% DEPC進行水解，紫外分光光度儀設置為1.8～2.0，在-70℃環境下保存。行25 μL反應體系逆轉錄，嚴格按照相關試劑盒說明操作，將第一鏈cDNA保存在-20℃環境下。

1.3.3 普通PCR? 設置退火溫度55℃對TLT1-TLR10以及GAPDH水平予以檢測。2×PCR均為10 μmol/L上下游引物，各0.5 μL。cDNA為1 μL，循環參數：94℃5 min預變性，94℃ 30 s，55℃ 30 s，共循環35次，在72℃溫度下進行5 min延伸。擴增處理后給予空白對照，實驗均反復3次。在1.2%瓊脂糖凝膠中加入8 μL擴增產物進行電泳，對成像結果予以觀察。

1.3.4 流式細胞儀檢測? 本部分研究對于TLRs表達采取免疫組織化學進行檢測。首先，將選取的新鮮活檢組織給予10.0%甲醛進行固定，并采取梯度酒精進行脫水處理，采取二甲苯透明和石蠟的包埋處理。將石蠟切片進行HE染色，并且在每張切片滴加相應對應的一抗，最后進行DAB顯色和蘇木精復染處理，并在顯微鏡下進行觀察與判斷。見封三圖3。

1.3.5 Real-time PCR檢測TLRs mRNA表達量的變化? 本部分研究采用實時定量熒光PCR（Real-time PCR）法檢測乳腺癌組織中TLR3、TLR4、TLR5和TLR9 mRNA的水平情況。①RNA提?。喝∧[瘤組織，TRIzol勻漿后加入氯仿震蕩、離心，取上清，加入異丙醇，震蕩后離心，空氣干燥，測RNA濃度。②cDNA合成，取RNA，加入引物、反應底物后，適宜條件下反應，檢測cDNA。③以cDNA為模板，加入SYBGREEN和引物行PCR擴增，檢測 TLRs mRNA水平變化。同時以管家基因葡萄糖磷酸脫氧酶作為內參照，每份樣品均進行3次重復檢測，取其平均CT值用于分析。

以上所有實驗均開展3次，選取平均值。用于比較不同的檢測指標差異。

1.4 統計學方法

所得數據采用SPSS 21.0統計學軟件處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗;計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。采用Cellquest軟件對流式數據進行分析。

2 結果

2.1 流式細胞儀技術檢測表達比較

MDA-MB-231當中TLRs蛋白表達結果當中比較高的依次是TLR4、TLR6、TLR7以及TLR5，而在MCF-7當中TLR4和TLR6是蛋白表達水平最高的。見表1、圖1。

2.2 實時熒光定量PCR測定TLRs基因定量表達情況

乳腺癌細胞株MDA-MB-231中，TLR4表達為（25.67±1.12），是MCF-7的（12.22±1.40）倍（P<0.05），另外TLR6、TLR8及TLR9均顯著高于MCF-7對應表達，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 細胞免疫熒光測定TLR4蛋白表達情況

計算20個視野平均值，得到MDA-MB-231細胞TLR4陽性細胞表達率為（86±4）%，顯著高于MCF-7的（51±7）%，差異有統計學意義（t=19.415，P<0.01）。

3 討論

文獻報道，TLRs在天然免疫系統及小鼠、人類的腫瘤細胞中均呈廣泛表達[3]?，F有研究證實人宮頸癌細胞、前列腺癌細胞及胃癌細胞等均存在TLR4表達[4]。乳腺癌越早期發現、治療則預后較好，因此，早期診斷和治療具有重要意義。超聲檢查作為一種快捷、安全、無創的檢查方法，目前成為乳腺疾病診斷的主要手段之一，由于病灶的硬度與周圍正常組織往往不同，惡性腫瘤的病變組織自身較堅硬，并與附近組織粘連，硬度會更大[5-6]。彈性成像技術可通過檢測乳腺病灶與周圍組織的相對硬度從而輔助診斷乳腺病灶的良惡性[7]。炎癥因子的過度表達及慢性炎癥微環境適應和促進了腫瘤細胞的增殖、生長、血管形成和轉移，增加發展成惡性腫瘤的風險[8]。TLRs是新近發現的參與非特異性免疫（天然免疫）的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。其可營造炎癥微環境導致腫瘤形成，并在腫瘤形成基礎上促進腫瘤進展[9-10]。

我們通過檢測乳腺癌患者腫瘤組織彈性與其TLR3、TLR4、TLR5和TLR9 mRNA的表達情況，探討其在研究對象腫瘤組織中表達的差異與腫瘤彈性變化的關系，旨在為乳腺癌的診治提供實驗診斷參考和療效評價標準。TLR4激活的信號通路與腫瘤的發展有密切的關系[11]。近年研究發現，TLR4在很多腫瘤細胞系和腫瘤組織中表達上調。TLR4信號途徑對前列腺癌的生長及轉移有著一定的促進作用[12]。在TLR4及NF-κB依賴途徑下，細菌內毒素LPS能夠激活尿激酶纖維蛋白溶酶，增強結直腸癌細胞黏附及侵襲能力[13]。

已有不少學者開展了Toll樣受體相關的內容研究，如肖薔[14]分析了在乳腺癌細胞系當中Pirh2、p53表達的意義，發現Pirh2、p53的表達與乳腺癌細胞侵襲轉移能力相關，王濤等[15]分析了Toll樣受體4活化增強乳腺癌細胞株MCF-7侵襲力的效果，發現脂多糖可增強MCF-7細胞株TLR4的表達，增強乳腺癌細胞的侵襲力。李娜等[16]分析缺氧誘導因子-2α在不同侵襲能力乳腺癌細胞和組織中的表達及意義，發現缺氧誘導因子-2α可能與乳腺癌轉移有關。唐樂輝等[17]則是研究了在乳腺癌當中Toll樣受體在乳腺癌轉移機制當中的作用，發現TRIF可能促進乳腺癌的增殖、分化。除此之外，還有其他學者對Toll樣受體在乳腺癌組織中的表達結合青島地區開展研究，發現TLRs乳腺癌中高表達，TLR2可能增加青島地區女性患乳腺癌的風險[18]。衛文俊等[19]分析了TLR4在乳腺癌組織中的表達與微血管密度的關系及臨床意義，發現TLR4在乳腺癌組織中表達增高，可促進新微血管的形成。張馨月等[20]也開展了Toll樣受體與乳腺癌、通路相關銜接蛋白之間的關系，為中醫藥抗乳腺癌的運用及明確其作用機制提供了實驗依據。這些均為研究理論的豐富奠定了堅實的基礎。

本研究發現，MDA-MB-231及MCF-7均存在TLR1～TLR10在mRNA中表達。乳腺癌細胞株MDA-MB-231中，TLR4、TLR5及TLR6高表達，而MCF-7中TLR5高表達。經實時熒光定量PCR測定發現，乳腺癌細胞株MDA-MB-231的TLR4、TLR6、TLR8及TLR9均高于MCF-7。在蛋白質水平上，MDA-MB-231當中TLRs蛋白表達結果當中比較高的依次是TLR4、TLR6、TLR7以及TLR5，而在MCF-7當中TLR4和TLR6是蛋白表達水平較高，與mRNA水平基本一致。表明TLR4與TLR6是2株細胞間差異較大的受體，而TLR4差異最明顯。TLR4與腫瘤的轉移有密切關系，促進了乳腺癌的生長、黏附及侵襲。另外，本研究中TLR1、TLR3～8、TLR10在2株細胞間差異表達，可能與乳腺癌細胞轉移能力相關，參與其轉移過程。

此次研究發現TLRs的差異化表達與乳腺癌細胞轉移能力具有一定的相關性，且TLRs在乳腺癌轉移中具有重要的參與作用，該結論能夠為乳腺癌轉移機制研究提供借鑒。

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（收稿日期：2018-11-23）