結直腸癌中腫瘤相關巨噬細胞及基因表型的分析研究

武艷飛 白雪峰 王智

[摘要] 目的 結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）中腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）CD68+及CD163+的檢測及與基因表型的關系。 方法 免疫組化方法檢測41例CRC腫物，癌旁5 cm（M5）、10 cm（M10）。不典型增生（Atypical hyperplasia，AH）組織CD68+及CD163+的表達，采用病理切片掃描儀細胞計數。對41例CRC腫物進行基因檢測。 結果 CRC患者CD68+及CD163+檢測腫物組織高于癌旁5 cm、10 cm（P<0.01）;腫物與不典型組織比較差異無統計學意義（P>0.05）;癌旁組織M5與M10比較差異無統計學意義（P>0.05）;回歸分析提示CD163+表達與K-ras基因突變有顯著性關系（P<0.05）。 CD68+及CD163+的表達與B-raf基因突變、MSS（微衛星穩定型）、淋巴結轉移、脈管癌栓、神經侵犯無相關性（P>0.05）。 結論 CD68+及CD163+在結直腸癌腫物間質中高表達，并高于癌旁組織，與AH表達無相關性。CD163+在腫物的表達與K-ras基因突變有相關性。

[關鍵詞] 結直腸癌;CD68+;CD163+;基因檢測;病理切片掃描儀

[中圖分類號] R730.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）17-0036-05

[Abstract] Objective To detect the expression of CD68+ and CD163+ in tumor-associated macrophages（TAMs） in colorectal cancer（CRC） and its relationship with gene phenotype. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD68+ and CD163+ in 41 cases of CRC， paracancer 5 cm（M5）， 10 cm（M10）， and atypical hyperplasia（AH） tissues. Cell counts were performed using a pathological slice scanner. Gene detection was performed on 41 CRC tumors. Results The expression of CD68+ and CD163+ in CRC patients was higher than that of paracancer 5 cm and 10 cm tissues（P<0.01）. There was no significant difference between tumor and atypical tissue（P>0.05）. The difference was not statistically significant between paracancer M5 and M10 tissues（P>0.05）. Regression analysis indicated that CD163+ expression was significantly associated with K-ras gene mutation（P<0.05）. The expression of CD68+ and CD163+ was not associated with B-raf gene mutation， MSS（microsatellite stable）， lymph node metastasis， vascular tumor thrombus， and neurological invasion（P>0.05）. Conclusion CD68+ and CD163+ are highly expressed in the interstitial of colorectal cancer， and higher than the adjacent tissues， and have no correlation with AH expression. The expression of CD163+ in the tumor is correlated with the K-ras gene mutation.

[Key words] Colorectal cancer; CD68+; CD163+; Gene detection; Pathological slice scanner

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是發展中國家癌癥死亡的主要原因之一。發達國家每年有1，300，000個新病例被診斷出來，而CRC則是其中之一。目前，外科手術切除是CRC唯一可能的治療方法。在臨床中，約有20%～25%的新診斷CRC患者出現遠處轉移，而且僅有很少一部分可以接受治療性手術，此外，大約50%的CRC患者在切除腫瘤2年內會復發。研究表明，癌癥不僅是由腫瘤細胞固有的激活關系來定義的，而且還由腫瘤相關微環境（The tumor microenvironment，TME）[1]招募和激活的免疫細胞來定義。迄今為止，免疫細胞在與腫瘤相關的微環境中的作用研究較少。與目前用于結直腸癌分期的組織病理學方法相比，免疫細胞在腫瘤樣本中的位置更能預測患者的病情進展[2，3]。本研究通過對腫瘤相關巨噬細胞（Tumor-associated macrophage，TAMs）標記物[4]CD68+、CD163+的表達水平[5]浸潤腫瘤組織與癌旁組織、不典型增生的比較性研究，分析與基因突變、淋巴結轉移及脈管神經侵犯的的關系，為臨床治療及預后監測提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月～2018年9月包頭市腫瘤醫院腫瘤切除的41例CRC患者的病歷進行回顧性分析。所有的患者均未行手術治療前的新輔助化療或放療。取腫瘤組織及癌旁5 cm及10 cm標本，41例結直腸癌患者中男26例，女15例。年齡37～86（63.76±10.01）歲，中位年齡64歲。其中結腸癌11例，直腸癌30例。有腸系膜淋巴結轉移的19例，未見腸系膜淋巴結轉移的22例。可見脈管侵犯的8例，未見脈管侵犯的33例。可見神經侵犯的10例，未見神經侵犯的31例。基因檢測MSS（微衛星穩定型）30例，MSI-L（微衛星低度不穩定型）6例，MSI-H（微衛星高度不穩定型）5例;B-raf有1例存在基因V600E突變，其余表達均為陰性;K-ras表達19例出現基因突變[6]，22例為野生型。病理分型黏液腺癌4例，中分化腺癌24例，低分化腺癌13例。這些CRC患者的標本固定石蠟包埋。組織標本從病理檔案中檢索。患者信息通過電子設備獲取醫療記錄。包括年齡、性別、是否發生脈管癌栓及神經侵犯、腫瘤位置和腫瘤的描述。

1.2 主要儀器與試劑

CD68（克隆號kp1，批號180815041d）CD163（克隆號10D6，批號180613206b）鼠單克隆抗體，免疫組化S-P法檢測試劑盒，DAB染色試劑盒，購自福建邁新生物工程有限公司。DAKO免疫組化儀（Autostainer Link 48）;LUMATAS免疫組化儀（Titan）;VENTANA免疫組化儀（Benchmark XT）。病理切片掃描儀，購自日本濱松光子學株式會社。基因檢測試劑盒，購自北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司。PCR熒光定量檢測儀。

1.3 免疫組化流程及細胞判讀標準

1.3.1 免疫組化流程? 取結直腸癌患者的腫瘤組織，距腫瘤5 cm、10 cm處、不典型增生組織，每個標本進行3 μm切片，裱片在防脫載玻片上，二甲苯脫蠟無水乙醇脫二甲苯。經二甲苯脫蠟切片，水化后，進行抗原修復，室溫孵育;孵育后用PBS洗滌，滴加一抗CD68+及CD163+ 37℃孵育1 h，用PBS洗滌后滴加二抗37℃孵育20 min，PBS洗凈后滴加新配置的DAB試劑;再經復染、分化、返藍、脫水、透明、封片、讀片觀察結果。

1.3.2 細胞判讀標準? 采用病理切片掃描儀掃描切片，低倍鏡下對切片進行掃描，確定腫瘤密度TAMs最高的區域即熱點區，在30倍視野下進行細胞計數。數10個視野取平均值，陽性細胞染色標準：細胞結構清晰，細胞漿、細胞膜染色明顯，著色和背景對比清晰。

1.4 基因檢測

1.4.1 DNA提取? 石蠟切片，厚度8 μm，5～6張。將切片裝于1.5 mL無菌離心管中，脫蠟，脫二甲苯。加入200 μL 緩沖液GA（Buffer GA）和20 μL Proteinase K進行孵育。再加入250 μL無水乙醇后離心，加入吸附柱CR2中，依次加220 μL緩沖液GB（Buffer GB）離心、500 μL緩沖液GD（Buffer GD）離心、2次600 μL漂洗液PW（Buffer PW）離心。放置5 min吸附柱CR2轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜滴加30～100 μL緩沖液TE，室溫放置5 min，離心，將收集有DNA的離心管-20℃保存。

1.4.2 PCR擴增? 分別加12.5 μL（B-raf、K-ras及MSI）反應液、6.5 μL 引物和4 μL水，加入已提取的DNA樣本，離心后進行PCR擴增反應及一代基因測序。進行實驗結果分析。

1.5 統計學分析

應用SPSS 22.0統計軟件，將病理切片掃描儀的數據進行統計學分析，其中CD163+的表達情況不符合正態分布，腫物與癌旁5 cm、癌旁10 cm、不典型增生組織CD68+、CD163+ TAM的表達情況及差異用非參數Kruskal-Wallis檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni法，檢驗標準（α）為0.05。腫瘤組織中兩種標記物表達量與病理參數的比較采用二元Logistic回歸分析，P<0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC中CD68+、CD163+巨噬細胞的表達與癌旁組織的比較

CD68+、CD163+在腫瘤組織表達不均[6]，主要在腫瘤的間質，多見于腫瘤壞死區的周圍[7]。而癌旁組織及不典型增生組織表達多見于黏膜層。兩者在腫瘤組織的表達水平均明顯高于癌旁5 cm、10 cm（P<0.01），腫瘤組織與不典型增生組織比較，無統計學差異（P>0.05），癌旁5 cm與癌旁10 cm比較表達水平無統計學差異（P>0.05），提示結直腸癌組織中存在腫瘤相關巨噬細胞浸潤。因此在不典型組織中CD68+、CD163+的表達與腫瘤組織無統計學差異，癌旁5 cm與癌旁10 cm的表達無統計學差異（表1、封三圖4）。

2.2 CRC中CD68+、CD163+巨噬細胞的表達與病理參數關系進行回歸分析

基因檢測MSS（微衛星穩定型）30例，MSI-L（微衛星低度不穩定型）6例，MSI-H（微衛星高度不穩定型）5例將MSI不穩定型的歸為一組;B-raf基因一例出現V600E突變，其余均為野生型;K-ras表達18例出現體細胞突變，突變形式B（Gly12Asp）5例、F（Gly 12Val）5例、D（Gly12Cys）4例、E（Gly12Ser）2例、G（Gly 13Asp）2例，將有突變的歸為一組，與未出現突變的一組進行比較;采用二元Logistic回歸分析，結果表明，CD163+巨噬細胞的表達與K-ras基因突變有相關性（P<0.05）。CD68+、CD163+巨噬細胞的表達與MSS、B-raf基因突變、淋巴結（Lymphonodus，L）轉移及脈管癌栓（Vessel carcinoma embolus，VC）及神經（Nerve，N）侵犯無相關性（P>0.05），CD68+巨噬細胞的表達與K-ras基因突變無相關（P>0.05）。見表2、圖1、2。

3 討論

在過去的研究中，癌癥細胞的基因組和生物學變化被廣泛地研究，以確定不同預后和治療反應的患者亞群，以及尋找潛在的藥物靶點。現在人們認識到，TME對腫瘤細胞具有重要的支持作用。免疫細胞是腫瘤的主要組成部分微環境，通過與腫瘤的相互作用影響腫瘤進展和轉移細胞。巨噬細胞通常是腫瘤微環境免疫細胞中最豐富的組成部分。巨噬細胞被認為具有表型和功能性可塑性，可以根據細胞的位置和腫瘤微環境中的細胞因子環境[8]，將其極化成M1或M2 巨噬細胞狀態[9]。一般來說M1巨噬細胞，也被稱為經典激活巨噬細胞，M2巨噬細胞是參與免疫調節、抗炎和支持腫瘤的活動。CD68在正常細胞和腫瘤細胞中廣泛表達，使該蛋白不特異于單核細胞/巨噬細胞家族，是人類單核細胞和巨噬細胞的廣泛標記;CD163（Cluster of Differentiation 163）清道夫受體為富含半胱氨酸的膜蛋白[10]，位于吞噬細胞表面，CD163是一種血紅蛋白/結合珠蛋白復合物清除受體，位于吞噬細胞表面，只在循環單核細胞和組織巨噬細胞上表達，被認為是M2巨噬細胞的重要特異性標志物。M2巨噬細胞產生的許多因子促進腫瘤惡化，刺激腫瘤的生長[11，12]。

CD68+和CD163+標記[13]對巨噬細胞的定義可能有些不夠全面，因為巨噬細胞是高度可塑性的細胞，可以顯示一系列表型。然而，標記巨噬細胞仍可用于識別不同巨噬細胞群體的主要表型或功能。雖然我們用CD68+和CD163+標記檢測巨噬細胞表達的，但仍有可能不是所有的巨噬細胞都表達這些標記物，因此在本研究中可能會失去部分巨噬細胞。還需要進一步的研究來驗證，并尋找更特異的標志物。因此，通過檢測基因MSS，B-raf及K-ras探討與巨噬細胞的浸潤的相關性[14]，尋找更多的方法研究腫瘤的性質和特點。

本實驗通過免疫組化S-P法檢測腫瘤部位、癌旁組織及不典型增生組織的表達情況，采用病理切片掃描儀進行細胞計數，30倍背景下10個視野取平均值，盡量減少誤差。由于小樣本病例研究，CD163+的表達不符合正態分布。因此采用非參數檢驗提示腫瘤組織中存在CD68+、CD163+巨噬細胞的浸潤，且高表達于癌旁組織。

本次研究結果表明CD163+的表達水平與K-ras基因突變存在相關性。在CRC中通常有40%患者檢測到K-ras突變。K-ras蛋白是EGFR信號傳導通路中關鍵的下游調節因子，巨噬細胞的EGFR信號通路是結腸炎相關癌變（colitis-associated carcinogenesis，CAC）的關鍵組成部分[15]。一項生物體內侵襲實驗表明TAMs通過腫瘤細胞和TAMs之間的旁分泌信號途徑促進細胞運動和侵襲，巨噬細胞在這個途徑中表達EGF，促進細胞形成細長的突起并被癌細胞侵襲[16]。

研究發現K-ras突變除了促進細胞內在的增殖和血管生成作用外，還可驅動具有M2 TAM極化的免疫抑制性腫瘤微環境[17，18]，募集骨髓來源的抑制性細胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs），并增加Treg/Th17反應，這可能是由IL-6自分泌和旁分泌方式共同作用的結果。IL-6阻斷不僅對腫瘤（上皮）細胞具有直接抑制作用，而且還可以使親腫瘤免疫抑制環境向抗腫瘤表型轉化[19]。因此巨噬細胞M2可能參與或影響了K-ras的突變路徑，CD163+的表達水平增高，是否提示K-ras的突變率增加。

綜上所述，巨噬細胞在TME中產生重要作用，影響腫瘤的發生發展。腫瘤內TAM計數與CRC腫瘤惡性程度相關[20]，腫瘤組織中TAM的計數高于癌旁組織。CD163+巨噬細胞M2表達與K-ras突變有相關性。K-ras突變驅動具有M2 TAM極化的免疫抑制性腫瘤微環境。巨噬細胞M2可能參與或影響K-ras的突變路徑，M2巨噬細胞增加與K-ras突變可能性增加相關，這將為CRC的病情進展評估提供參考。

[參考文獻]

[1] Ngabire D，Kim GD.Autophagy and inflammatory response in the tumor microenvironment[J]. Int J Mol Sci，2017，18（9）：1231-1232.

[2] Shibutani M，Maeda K，Nagahara H，et al. The peripheral monocyte count is associated with the density of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment of colorectal cancer a retrospective study[J]. BMC Cancer，2017，17（1）：404-412.

[3] Ohno S，Ohno Y，Suzuki N，et al.Correlation of histological localization of tumor-associated macrophages with clinicopatho-logical features in endometrial cancer[J].Anticancer Res，2004，24（5C）：3335-3342.

[4] Netea-Maier RT，Smit JWA，Netea MG.Metabolic changes in tumor cells and tumor-associated macrophages：A mutual relationship[J]. Cancer Lett，2018，413：102-109.

[5] 何岸江，胡衛軍，李霄，等.CD68+、CD163+巨噬細胞在結直腸癌組織中的浸潤及意義[J].結直腸肛門外科，2017，2304：440-444.

[6] Cheon SK，Kim HP，Park YL，et al. Macrophage migration inhibitory factor promotes resistance to MEK blockade in K-ras mutant colorectal cancer cells[J]. Mol Oncol，2018，12（8）：1398-1409.

[7] Koelzer VH，Canonica K，Dawson H，et al. Phenotyping of tumor-associated macrophages in colorectal cancer Impact on single cell invasion（tumor budding） and clinicopathological outcome[J].Oncoimmunology，2015，5（4）：1589-1596.

[8] Kim Y，Wen X，Bae JM，et al. The distribution of intratumoral macrophages correlates with molecular phenotypes and impacts prognosis in colorectal carcinoma[J].Histopathology，2018，73（4）：663-671.

[9] Sawa-Wejksza K，Dudek A，Lemieszek M，et al. Colon cancer-derived conditioned medium induces differentiation of THP-1 monocytes into a mixed population of M1/M2 cells[J].Tumour Biol，2018，40（9）：579-610.

[10] Huang X，Pan Y，Ma J，et al. Prognostic significance of the infiltration of CD163（+） macrophages combined with CD66b（+） neutrophils in gastric cancer[J]. Cancer Med，2018，7（5）：1731-1741.

[11] Vinnakota K，Zhang Y，Selvanesan BC，et al. M2-like macrophages induce colon cancer cell invasion via matrix metalloproteinases[J]. Cell Physiol，2017，232（12）： 3468-3480.

[12] Dong R，Gong Y，Meng W，et al.The involvement of M2 macrophage polarization inhibition in fenretinide-mediated chemopreventive effects on colon cancer[J]. Cancer Lett，2017，388：43-53.

[13] Zheng X，Turkowski K，Mora J et al.Redirecting tumor-associated macrophages to become tumoricidal effectors as a novel strategy for cancer therapy[J]. Oncotarget，2017， 8（29）：48436-48452.

[14] Xiong Y，Wang K，Zhou H，et al. Profiles of immune infiltration in colorectal cancer and their clinical significant：A gene expression-based study[J]. Cancer Med，2018， 7（9）：4496-4508.

[15] Hardbower DM，Coburn LA，Asim M et al. EGFR-mediated macrophage activation promotes colitis-associated tumorigenesis[J]. Oncogene，2017，36（27）：3807-3819.

[16] Pateras IS，Cooks T.Determination of polarization of resident macrophages and their effect on the tumor microenvironment[J].Methods Mol Biol，2019，1928：101-112.

[17] Ji H，Houghton AM，Mariani TJ，et al. K-ras activation generates an inflammatory response in lung tumors[J].Oncogene，2006，25（14）：2105-2112.

[18] Zhu Z，Aref AR，Cohoon TJ，et al. Inhibition of KRAS-driven tumorigenicity by interruption of an autocrine cytokine circuit[J]. Cancer Discovery，2014，4（4）：452-465

[19] Mauer J，Chaurasia B，Goldau J，et al. Signaling by IL-6 promotes alternative activation of macrophages to limit endotoxemia and obesity-associated resistance to insulin[J].Nature immunology，2014，15（5）：423-430.

[20] Fang H，Ang B，Xu X，et al. TLR4 is essential for dendritic cell activation and anti-tumor T-cell response enhancement by DAMPs released from chemically stressed cancer cells[J].Cell Mol Immunol，2014，11（2）：150-159.

（收稿日期：2018-12-20）