Hec1在膀胱癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系

蘇 宏，宋 博，張珊珊，李 青，于新路，王 雪，高萬(wàn)峰

有絲分裂是細(xì)胞增殖周期中的主要階段，在真核細(xì)胞分裂產(chǎn)生體細(xì)胞的過(guò)程中，任何一種調(diào)節(jié)機(jī)制出現(xiàn)異常均可引起染色體不穩(wěn)定性，進(jìn)而影響著腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展。癌癥高表達(dá)蛋白(high expression in cancer，Hec1)由人hec基因編碼，是一種富卷曲結(jié)構(gòu)的核蛋白，是紡錘體正確組裝的重要復(fù)合物[1]。研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，Hec1的異常表達(dá)影響著細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展，可能是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要修飾基因。盡管Hec1在多種器官的生理生化功能研究較多，但其在生理機(jī)制及發(fā)生作用等方面的信息還比較匱乏，國(guó)內(nèi)關(guān)于Hec1在人膀胱癌組織中的表達(dá)及意義還未見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用EnVision免疫組織化學(xué)法和Western印跡法檢測(cè)膀胱癌及正常膀胱組織中Hec1的表達(dá)，探討其與膀胱癌臨床生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)本取自2008-08至2012-05手術(shù)切除的膀胱癌標(biāo)本105例，其中武警遼寧總隊(duì)醫(yī)院23例，遼寧省人民醫(yī)院82例。年齡38～87歲，中位年齡55.8歲。所有病例均為初次手術(shù)，術(shù)前均未行介入、放化療等治療，所有術(shù)后標(biāo)本均由高年資病理醫(yī)師參照第九版Arkman外科病理學(xué)[2]標(biāo)準(zhǔn)作出診斷，均證實(shí)為膀胱癌。組織學(xué)分級(jí)參照Elson and Ellis半定量三級(jí)分類法：Ⅰ級(jí)51例，Ⅱ級(jí)39例，Ⅲ級(jí)15例；臨床TNM分期采用NCCN(2010)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行界定[3]：Ⅰ期31例，Ⅱ期23例，Ⅲ+Ⅳ期51例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者71例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；腫瘤直徑≤2 cm患者49例，2～5 cm患者35例，>5 cm患者21例。另取距離癌灶>5 cm處正常腎組織20例作為對(duì)照。

1.2 試劑 兔源性Hec1多克隆抗體購(gòu)自上海鼎杰生物技術(shù)有限公司，Hec1兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，濃度1∶100。每次染色均以膀胱癌陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué) 常規(guī)方法脫蠟，石蠟組織塊經(jīng)4 μm連續(xù)切片，EnVision法檢測(cè)Hec1的表達(dá)，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每次染色均以膀胱癌陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。免疫組化染色結(jié)果采用雙盲法判定。

1.3.2 Western印跡 于4 ℃下取等量標(biāo)本(1～2 g)，加大5倍濕重裂解緩沖液，粉碎勻漿后，4 ℃靜置24 h，低溫高速離心。取上清為總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。取下凝膠40 V轉(zhuǎn)印2 h，封閉后與抗Hec1和抗β-actin孵育過(guò)夜。經(jīng)TBS、TTBS洗滌后與二抗(1∶50)室溫下孵育1 h，TTBS、TBS洗滌，DAB顯色。結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀(Chemilmager 5500，美國(guó))采集，進(jìn)行灰度值檢測(cè)。

1.4 結(jié)果判定 每張切片均由兩位高級(jí)職稱病理醫(yī)生獨(dú)立閱片，兩位診斷意見(jiàn)均為陽(yáng)性方視為陽(yáng)性。按照著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)算評(píng)分。其中不著色者記0分，淡黃色記1分，棕黃色者記2分，棕褐色記3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，76%～100%記4分。著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分率的得分相乘的積即為最終得分，≥6分者即判定為陽(yáng)性，<6分者即判定為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，Hec1的表達(dá)率與患者各臨床因素之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。生存分析采用K-M方法和Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hec1在膀胱癌及正常組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，105例膀胱癌標(biāo)本中，Hec1的陽(yáng)性表達(dá)率為78.2%(82/105)，陽(yáng)性產(chǎn)物分布于胞核，均顯示為黃色-棕褐色顆粒。在正常組織中Hec1的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)15.0%(3/20)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 Hec1的表達(dá)與膀胱癌臨床病理因素的關(guān)系 Hec1的表達(dá)與患者的年齡、組織學(xué)分級(jí)及腫瘤大小均無(wú)關(guān)。但Hec1在膀胱癌中的表達(dá)隨臨床TNM分期的升級(jí)(P=0.042)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)(P=0.033)，Hec1的表達(dá)水平逐漸升高；5年生存的患者中Hec1(+)表達(dá)率低于沒(méi)有達(dá)到5年生存的患者(χ2=5.665，P=0.021，表1)。

表1 Hec1的表達(dá)與膀胱癌臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性 (n；%)

2.3 Hec1的表達(dá)與膀胱癌預(yù)后的相關(guān)性分析 采用K-M法進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示Hec1(+)表達(dá)的病例無(wú)病生存率明顯較Hec1(-)表達(dá)的病例差(P=0.025，圖1)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及Hec1為影響膀胱癌預(yù)后的獨(dú)立因子(表2)。

表2 Cox多因素分析膀胱癌預(yù)后的影響因素

圖1 膀胱癌患者5年生存曲線

3 討 論

細(xì)胞周期檢查點(diǎn)是保證DNA復(fù)制和染色體分配質(zhì)量的檢查節(jié)點(diǎn)，是一類負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。其中，處于有絲分裂期的紡錘體組裝檢查點(diǎn)是防止染色體分離錯(cuò)誤的控制關(guān)鍵，可起到抑制細(xì)胞進(jìn)入后期的作用，直至所有已復(fù)制的染色單體均與紡錘體有效結(jié)合。Hec1是紡錘體組裝檢查點(diǎn)復(fù)合物的重要組分，最初是以Rb蛋白為“介質(zhì)”，通過(guò)酵母雙雜交的方法被發(fā)現(xiàn)，因其在癌癥中表達(dá)明顯高于正常組織而被命名。Hec1在紡錘體的正確組裝、染色體正確排列以及找尋有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白的過(guò)程中起到重要作用[4，5]。

近年多項(xiàng)研究表明，Hec1的表達(dá)突變?cè)诙喾N腫瘤組織的形成中發(fā)揮重要作用，文獻(xiàn)[6，7]報(bào)道，Hec1在胃癌、乳腺癌等中表達(dá)明顯增高，高表達(dá)的Hec1刺激癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)展，可能扮演致癌基因的角色，協(xié)同參與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展。文獻(xiàn)[8，9]通過(guò)加入特異性Hec1抗體發(fā)現(xiàn)以下幾種有絲分裂的異常：染色體凝集但分離異常；中期染色體赤道板無(wú)法形成；紡錘體不能引導(dǎo)染色單體兩極化；細(xì)胞分裂可以進(jìn)行，但是雜亂的染色體分離形成變異的不能存活的子代細(xì)胞。這些結(jié)果證實(shí)Hec1在細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用。

本研究結(jié)果顯示，Hec1在膀胱癌組織中的表達(dá)率(78.2%)明顯高于正常膀胱組織(15.0%)，Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，Hec1在膀胱癌組織中的表達(dá)亦顯著高于癌旁正常組織，這一結(jié)果與Hec1在胃癌、結(jié)腸癌中表達(dá)增高的研究結(jié)果相一致，符合其在某些腫瘤的生長(zhǎng)中起正向促進(jìn)調(diào)節(jié)作用的條件之一。因各種因素致Hec1與著絲粒結(jié)合的減弱被證明是Hec1表達(dá)增高的主要可能性因素[10]。

本研究首次從蛋白水平檢測(cè)了膀胱癌組織Hec1 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果提示Hec1的表達(dá)與患者的年齡、組織學(xué)分級(jí)及腫瘤大小均無(wú)關(guān)。但Hec1在膀胱癌中的表達(dá)隨臨床TNM分期的升級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，表達(dá)水平逐漸增高。此外，本研究還證實(shí)，在Hec1(+)表達(dá)的患者中，其5年生存率明顯低于Hec1(-)表達(dá)的患者組。采用K-M法進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示Hec1(+)表達(dá)的病例預(yù)后明顯較Hec1(-)表達(dá)的病例差。盡管Hec1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究還較少，但基于以上結(jié)果，筆者認(rèn)為Hec1 的表達(dá)可能維持了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化表型，在腫瘤的發(fā)生及癌變轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，其表達(dá)水平的增高促進(jìn)了癌組織表現(xiàn)侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力。最近研究發(fā)現(xiàn)[11]，抑制腫瘤細(xì)胞中Hec1的表達(dá)可以促使著絲粒與微管結(jié)合力的減弱，在微管正常的情況下，少量持續(xù)存在的有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白(MAD2)可以引起有絲分裂檢查點(diǎn)的持續(xù)激活，從而引起長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。目前有研究發(fā)現(xiàn)可針對(duì)Hec1的小分子抑制劑，并證明其能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)[12]。

綜上，Hec1在膀胱癌中的表達(dá)顯著高于正常膀胱組織，同時(shí)其表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、五年生存率等因素顯著相關(guān)，提示Hec1在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，可能起到腫瘤刺激基因的作用。從臨床診斷和治療角度考慮，針對(duì)Hec1的表達(dá)狀態(tài)來(lái)評(píng)估患者病情及尋找靶向治療藥物可能成為膀胱癌未來(lái)的主要研究方向。