sST2/IL-33與Th17/Treg相關細胞因子在原發免疫性血小板減少癥中的作用研究

王秀娟，孫明玲，劉穎，王蕾，王新有，劉洋，趙芳，秦玉婷，郭新紅

原發免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia,ITP）是一組以血小板計數減少，伴或不伴皮膚黏膜出血為特點的自身免疫性出血性疾病。該病的成人年發病率為（2～4）/10萬［1］。目前，研究認為多種細胞免疫功能異常參與了該病的發病機制［2］。既往大量研究表明，Th1/Th2亞群失衡可能參與了ITP的發病過程［3］。隨著研究的深入發現，Th17和Treg細胞間紊亂也參與了ITP的發病過程［4］。白細胞介素（IL）-33是近年來發現的IL-1家族的新成員，ST2是其特異性受體，有可溶型（sST2）和跨膜型（ST2L）兩種形式，IL-33可與受體ST2通過輔助蛋白相互作用，而sST2則作為誘騙受體結合IL-33，可阻斷ST2L/IL-33信號通路，介導Th17/Treg細胞免疫失衡，在自身免疫性疾病機制中發揮著重要的作用［5］。目前，對sST2/IL-33的研究主要集中在干燥綜合征、系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎等自身免疫性疾病［6］，但兩者在ITP疾病中的作用機制尚不明確。本研究通過檢測初治ITP患者血清sST2/IL-33與Th17/Treg相關細胞因子的表達水平，探討其在ITP發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月—2017年6月于新疆醫科大學第一附屬醫院血液病中心就診的30例ITP患者為研究對象（研究組），男11例，女19例，年齡16～66歲，平均（41.80±14.48）歲），血小板計數（platelet,PLT）為（3～28）×109/L。所有患者均符合《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2012年版）》，在確診前均未接受相關治療。選取同期20例健康體檢者為對照組，男8例，女12例，年齡16～65歲，平均（42.16±14.55）歲，血小板計數（114～256）×109/L。2組年齡（t=0.086）、性別（χ2=0.057）差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究方案在實施前，通過了新疆醫科大學第一附屬醫院臨床研究倫理委員會批準，所有受試對象均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 采集2組空腹靜脈血3 mL，2 500 r/min離心10 min，取上清血清置于1.5 mL EP管中，標記編號后置于-80℃冰箱中儲存備用，用于細胞因子的檢測。

1.2.2 標本檢測 采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中IL-33、sST-2、IL-17及轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平，上述細胞因子的ELISA試劑盒均購自美國eBioscience公司。嚴格按照試劑盒說明書操作。將需要檢測標本放置于室溫20 min，將50μL稀釋后的標準品、血清標本分別加入包被過夜的各反應孔中，置37℃孵育1 h后洗滌。將親和鏈霉素-HRP 80μL加入各反應孔中，振蕩混勻后于37℃孵育0.5～1 h后再次洗滌。每孔加入100μL TMB，振蕩混勻后于37℃避光溫育10 min，取出酶標儀，于各反應孔中加入2 mol/L硫酸50μL終止反應，讀取酶標儀450 nm處讀光密度（OD）值，根據繪制的標準曲線計算2組標本中IL-33、sST2、IL-17及TGF-β的濃度。

1.3 統計學方法 采用統計軟件SPSS 17.0進行統計學分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，滿足正態分布且方差齊性時，采用獨立樣本t檢驗，反之采用秩和檢驗，相關性分析采用Pearson相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組血清中IL-33、sST2、IL-17、TGF-β的表達水平比較 ITP組sST2、IL-17水平高于對照組，TGF-β表達水平低于對照組（P＜0.01），而IL-33表達水平與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of serum levels of sST2,IL-33,IL-17 and TGF-βbetween two groups表1 2組血清中sST2、IL-33、IL-17、TGF-β水平比較（ng/L，±s）

Tab.1 Comparison of serum levels of sST2,IL-33,IL-17 and TGF-βbetween two groups表1 2組血清中sST2、IL-33、IL-17、TGF-β水平比較（ng/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別n sST2IL-33IL-17TGF-β對照組ITP組t 20 30 189.2±23.7 222.8±32.6 3.958＊＊1 273.6±344.3 1 154.7±450.9 1.046 7.88±2.53 10.81±3.20 3.211＊＊3 121.6±938.8 2 489.8±703.8 2.763＊＊

2.2 ITP組血清中sST2的表達水平與IL-17、TGF-β的相關性分析 ITP組中sST2與TGF-β呈負相關（r=-0.471，P＜0.01），sST2與IL-17無相關性（r=0.189，P＞0.05）。

3 討論

ITP發病機制復雜多樣，除體液免疫機制參與該病的發病外，多種免疫細胞和細胞因子分泌異常也可導致自身免疫紊亂，致使ITP的發生［7］。Th17細胞和Treg細胞是新發現的CD4+T細胞亞群，在機體免疫調節中發揮著重要的作用。IL-17是Th17細胞分泌的特征性細胞因子，是發揮炎癥效應及介導自身免疫性疾病的關鍵因子。既往研究顯示，在ITP患者外周血清中IL-17表達水平增高，表明IL-17可能促進炎癥反應，參與ITP的發病機制［8］。本研究也發現，與對照組比較，ITP組血清中IL-17表達升高，與上述結果相符。與Th17細胞作用相反，Treg細胞可分泌TGF-β，發揮抑制炎癥反應和維持自身免疫耐受的作用，二者相互抑制與調節，若失衡會導致多種自身免疫性疾病的發生［9］。孫志強等［4］研究發現，ITP患者中Th17細胞數量增加，Treg細胞數量下降，認為在ITP發病過程中可能存在Treg/Th17的免疫調節失衡。本研究結果顯示，與對照組比較，ITP組血清中TGF-β水平降低，提示Treg細胞的減少可能會打破機體的免疫平衡，導致機體免疫抑制功能減弱，T細胞異常激活，Th17/Treg比例失衡可能在ITP的發病中發揮一定作用。

IL-33是近年來發現的IL-1家族的新成員，可與ST2L結合，從而調節多種免疫細胞的活化、增殖及細胞因子的分泌，在機體免疫反應中發揮著重要的作用［10］。研究顯示，ST2L可表達于Treg細胞，IL-33與其結合可促進Treg細胞的增殖，發揮免疫抑制作用［11］。sST2則作為誘騙受體結合IL-33，可阻斷ST2L/IL-33信號通路，對該通路起到負性調節作用［12］。臨床研究發現，與正常健康者相比，在類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者血清中IL-33、sST2水平表達升高，IL-33與IL-17/IL-10的比值呈正相關，提示IL-33可促使Th17細胞和Treg細胞失衡，參與了RA的發病過程［13］；在抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎中sST2水平升高，且在疾病活動時升高更為顯著，但未見IL-33表達水平升高，考慮可能的原因是IL-33在體內濃度較低，并能快速被水解所致［14］。目前，關于ST2L/IL-33在ITP中的研究甚少。本研究發現，在ITP患者中sST2表達水平較對照組明顯升高，且與TGF-β呈負相關，但IL-33水平與對照組比較差異并無統計學意義，而Li等［15］研究結果顯示，ITP組較健康對照者IL-33表達水平降低，sST2表達水平升高，與本研究結果不完全一致，筆者推測在ITP患者中，ST2L/IL-33信號通路對Treg細胞的調控可能不是IL-33，亦可能是通過ST2L和sST2的表達發揮作用，增高的sST2可阻斷Treg細胞的ST2L/IL-33信號通路，抑制Treg細胞增殖，導致TGF-β分泌減少，從而對Th17細胞抑制作用減少，致使IL-17分泌增多，最終出現Th17/Treg細胞失衡。

綜上所述，ITP患者體內存在Th17/Treg細胞失衡、sST2表達水平升高的現象，增高的sST2通過抑制ST2L/IL-33信號通路，可抑制淋巴細胞向Treg細胞亞群分化，促進其向Th17細胞亞群分化，導致ITP中的T淋巴細胞亞群的失衡，進而參與該疾病的免疫反應。至于sST2對ST2L/IL-33信號通路如何發揮作用，其具體機制仍有待進一步研究探討。