利用Time-lapse技術(shù)篩選早期胚胎對IVF-ET妊娠結(jié)局的影響

丁潔，孟慶霞，鄭愛燕，蒲艷，廖桂芝，許詠樂，李紅，王瑋

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

胚胎選擇技術(shù)是體外受精胚胎移植技術(shù)的關(guān)鍵步驟。目前，絕大多數(shù)中心利用傳統(tǒng)胚胎形態(tài)學(xué)評分方法選擇胚胎，即根據(jù)特定時間點的胚胎形態(tài)對胚胎進行評級、選擇。但該技術(shù)僅觀察特定的胚胎發(fā)育時間點，不能獲得胚胎發(fā)育的全部信息，且需要將胚胎反復(fù)取出培養(yǎng)箱，暴露于外界環(huán)境中，使得pH值和溫度發(fā)生改變，進而可能影響胚胎發(fā)育潛能。

而近年來興起的胚胎實時觀測技術(shù)(time-lapse monitoring，TLM)可以對胚胎進行動態(tài)監(jiān)測，不僅能夠保證胚胎觀察、評估過程中培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，而且可以獲得胚胎連續(xù)動態(tài)發(fā)育圖，以及胚胎發(fā)育過程中的非正常發(fā)育行為，如多核、異常分裂、混亂分裂、逆分裂等，進而為胚胎篩選提供更多參考信息。研究表明，利用TLM觀察到的胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)和特殊分裂模式可以預(yù)測囊胚的形成[1-5]。本中心前期研究也發(fā)現(xiàn)利用TLM技術(shù)可以預(yù)測6細胞以上碎片少的形態(tài)學(xué)優(yōu)質(zhì)D3胚胎的發(fā)育潛能[6]。但是，關(guān)于利用TLM預(yù)測臨床妊娠結(jié)局，結(jié)果不盡相同。一些研究認為細胞分裂時間點和分裂間期可以預(yù)測移植后胚胎的臨床結(jié)局[1，4，7]，而另一些研究則認為不能預(yù)測[3，8]。因此，本研究欲利用TLM系統(tǒng)對早期發(fā)育胚胎進行篩選，分析其對臨床結(jié)局的影響，探索其在臨床應(yīng)用中的價值。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析本中心2016年7月至2017年12月，第一次新鮮或復(fù)蘇周期移植，且移植D3胚胎的患者資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：受精方式為早補救或補救ICSI；移植胚胎評分為非優(yōu)質(zhì)；行植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing，PGT)。最后共篩得1 025例患者，根據(jù)胚胎篩選方案分為Time-lapse系統(tǒng)組(TLM，n=74)和傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評分組(CMA，n=951)。

二、研究方法

1.取卵受精：患者進行常規(guī)促排卵后取卵，待優(yōu)勢卵泡直徑達18～20 mm時，注射重組HCG(艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)250 μg，注射34～36 h后在陰道B超引導(dǎo)下取卵，獲得的卵丘卵母細胞復(fù)合物洗滌干凈后置于G-IVF Plus(Vitrolife，瑞典)，4～6 h后行IVF或ICSI。

2.胚胎培養(yǎng)：受精后的2PN胚胎，CMA組放入普通培養(yǎng)箱(COOK，美國)，培養(yǎng)箱環(huán)境：6.0% CO2，5.0% O2，37 ℃；TLM組放入 Embryoslide培養(yǎng)皿，置于Embryo Scope 時差培養(yǎng)箱(Vitrolife，瑞典)，培養(yǎng)箱環(huán)境：6.0% CO2，5.0% O2，37 ℃。設(shè)置拍攝間隔為10 min，連續(xù)拍攝6 d。

3.胚胎選擇和移植：CMA組根據(jù)傳統(tǒng)胚胎評分方法選擇優(yōu)質(zhì)胚胎，本中心D3優(yōu)質(zhì)胚胎的標(biāo)準(zhǔn)為：細胞數(shù)6～10個，胚胎碎片≤20%，卵裂球均勻。TLM組根據(jù)Embryo Scope D3評分原則[9]，選擇得分為5或4的胚胎。每組根據(jù)移植要求選出1～2枚最優(yōu)質(zhì)胚胎，行新鮮周期移植；不適合新鮮移植的患者將選出的優(yōu)質(zhì)胚胎冷凍，隨后行復(fù)蘇周期移植。

4.臨床結(jié)局：移植后14 d測血β-HCG，陽性者于4～6周后B超檢查見孕囊者為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間均數(shù)比較符合正態(tài)分布的采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗；率的比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般情況比較

在所有1 025個周期中，患者的不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)激素(FSH、LH、E2、AMH)水平、竇卵泡數(shù)、內(nèi)膜厚度和周期類型，在兩組間均無顯著差異(P均>0.05)；而TLM組年齡顯著大于CMA組(P<0.05)(表1)。

二、胚胎篩選方式對臨床結(jié)局的影響

TLM組的平均移植胚胎數(shù)顯著少于CMA組(P<0.05)，但臨床妊娠率在兩組間無顯著差異(P>0.05)；TLM組種植率略高于CMA組，但無顯著差異(P>0.05)；其余各項臨床指標(biāo)在兩組間無顯著差異(P均>0.05)(表2)。

組 別病例數(shù)年齡不孕年限BMI(kg/m2)基礎(chǔ)FSH(U/L)基礎(chǔ)E2(pmol/L)基礎(chǔ)LH(U/L)基礎(chǔ)AMH(ng/ml)CMA組95130.8±4.44.3±2.722.3±3.27.5±2.6163.7±78.95.3±3.23.8±3.2TLM組7431.8±4.2?4.8±3.122.2±3.37.3±1.8171.8±88.45.1±2.23.0±1.7組 別病例數(shù)竇卵泡數(shù)內(nèi)膜厚度(mm)移植方案不孕類型新鮮周期復(fù)蘇周期繼發(fā)原發(fā)CMA組9518.3±4.89.1±1.949.8(474/951)50.2(477/951)44.0(418/951)56.0(533/951)TLM組747.7±3.29.2±1.658.1(43/74)41.9(31/74)54.1(40/74)45.9(34/74)

注：與CMA組比較，*P<0.05

組 別病例數(shù)優(yōu)胚率HCG陽性率臨床妊娠率種植率CMA組95164.2(3 966/6 180)66.4(631/951)57.7(549/951)40.2(731/1 817)TLM組7463.7(319/501)63.5(47/74)55.4(41/74)43.7(55/126)組 別病例數(shù)流產(chǎn)率異位妊娠率平均移植胚胎數(shù)雙胎率移植兩個胚胎的雙胎率CMA組95113.1(72/549)3.5(19/549)1.9±0.336.2(199/549)40.3(199/494)TLM組7414.6(6/41)0(0/41)1.7±0.5?34.1(14/41)51.9(14/27)

注：與CMA組比較，*P<0.05

三、胚胎篩選方式對不同年齡患者臨床結(jié)局的影響

1.胚胎篩選方式對<35歲患者臨床結(jié)局的影響：所有一般情況，包括年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)激素(FSH、LH、E2、AMH)水平、竇卵泡數(shù)、內(nèi)膜厚度和周期類型，在兩組間均無顯著差異(P均>0.05)(表3)；TLM組的平均移植胚胎數(shù)顯著少于CMA組(P<0.05)，但臨床妊娠率在兩組間無顯著差異(P>0.05)；TLM組種植率略高于CMA組，但無顯著差異(P>0.05)；其余各項臨床指標(biāo)在兩組均無顯著差異(P均>0.05)(表4)。

2.胚胎篩選方式對≥35歲患者臨床結(jié)局的影響：所有一般情況，包括年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、E2、AMH、竇卵泡數(shù)、內(nèi)膜厚度和周期類型，在兩組間均無顯著差異(P均>0.05)(表5)；TLM組的平均移植胚胎數(shù)顯著少于CMA組(P<0.05)，但臨床妊娠在兩組間無顯著差異(P>0.05)；TLM組種植率略高于CMA組，但無顯著差異(P>0.05)；其余各項臨床指標(biāo)在兩組間無顯著差異(P均>0.05)(表6)。

組 別病例數(shù)年齡不孕年限BMI(kg/m2)基礎(chǔ)FSH(U/L)基礎(chǔ)E2(pmol/L)基礎(chǔ)LH(U/L)基礎(chǔ)AMH(ng/ml)CMA組78329.2±2.84.0±2.222.3±3.27.3±2.3160.0±70.85.4±3.44.1±3.3TLM組5129.5±2.64.0±2.121.7±2.97.4±1.9166.7±88.45.6±2.13.3±1.8組 別病例數(shù)竇卵泡數(shù)內(nèi)膜厚度(mm)移植方案不孕類型新鮮周期復(fù)蘇周期繼發(fā)原發(fā)CMA組7838.7±5.09.2±1.953.4(365/783)46.6(365/783)40.0(313/783)60.0(470/783)TLM組518.2±3.49.3±1.760.8(31/51)39.2(20/51)51.0(26/51)49.0(25/51)

組 別病例數(shù)優(yōu)胚率HCG陽性率臨床妊娠率種植率CMA組78363.9(3466/5426)69.9(547/783)61.2(479/783)42.9(646/1506)TLM組5163.8(231/362)70.6(36/51)58.8(30/51)47.7(42/88)組 別病例數(shù)流產(chǎn)率異位妊娠率平均移植胚胎數(shù)雙胎率移植兩個胚胎的雙胎率CMA組78312.9(62/479)3.5(17/479)1.9±0.338.2(183/479)40.6(183/451)TLM組516.7(2/30)0(0/30)1.7±0.5?40.0(12/30)57.1(12/21)

注：與CMA組比較，*P<0.05

組 別病例數(shù)年齡不孕年限BMI(kg/m2)基礎(chǔ)FSH(U/L)基礎(chǔ)E2(pmol/L)基礎(chǔ)LH(U/L)基礎(chǔ)AMH(ng/ml)CMA組16838.1±2.96.0±4.122.6±3.18.4±3.5179.8±107.54.5±2.32.1±1.9TLM組2336.9±1.76.5±4.123.3±3.77.2±1.6182.4±88.84.0±1.92.4±1.3組 別病例數(shù)竇卵泡數(shù)內(nèi)膜厚度(mm)移植方案不孕類型新鮮周期復(fù)蘇周期繼發(fā)原發(fā)CMA組1686.3±3.29.1±1.833.3(56/168)66.7(112/168)62.5(105/168)37.5(63/168)TLM組236.3±2.48.9±1.352.2(12/23)47.8(11/23)60.9(14/23)39.1(9/23)

組 別病例數(shù)優(yōu)胚率HCG陽性率臨床妊娠率種植率CMA組16866.3(500/754)50.0(84/168)41.7(70/168)27.3(85/311)TLM組2363.3(88/139)47.8(11/23)47.8(11/23)34.2(13/38)分組病例數(shù)流產(chǎn)率異位妊娠率平均移植胚胎數(shù)雙胎率移植兩個胚胎的雙胎率CMA組16814.3(10/70)2.9(2/70)1.9±0.422.9(16/70)37.2(16/43)TLM組2336.4(4/11)0(0/11)1.7±0.5?18.2(2/11)33.3(2/6)

注：與CMA組比較，*P<0.05

討 論

近年，TLM已被部分生殖中心引入并應(yīng)用于臨床，該技術(shù)被認為是一項能夠監(jiān)測胚胎發(fā)育的安全的胚胎培養(yǎng)體系[10-12]。大部分研究認為TLM記錄胚胎形態(tài)動力學(xué)指標(biāo)能夠預(yù)測胚胎發(fā)育潛能和囊胚形成效率，但是關(guān)于TLM選擇胚胎能否改善臨床結(jié)局，說法不一[13-15]。

本研究中，TLM組的年齡顯著高于CMA組，且TLM組的平均移植胚胎數(shù)顯著少于CMA組，但兩者的臨床妊娠率之間無顯著差異(P>0.05)。表明利用TLM選擇胚胎，可以在顯著減少移植胚胎數(shù)的基礎(chǔ)上，維持穩(wěn)定的臨床妊娠率，提示TLM技術(shù)可以為早期胚胎單胚胎移植技術(shù)的開展提供一定手段。雖然TLM組種植率比CMA組高，但兩者無顯著差異(P>0.05)，該結(jié)果與Wu等[16]研究結(jié)果一致。另外，就移植兩個胚胎的雙胎率，TLM組和CMA組分別為51.9%和40.3%，雖然兩者無顯著差異(P>0.05)，但是TLM組移植兩個胚胎的雙胎率有增高的趨勢。這與Insua等[14]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)TLM組的多胎分娩率高于CMA組。母體子宮環(huán)境和胚胎質(zhì)量是影響胚胎種植的兩大因素。基于本研究結(jié)果，有理由認為在子宮容受條件好的患者中，TLM選擇的胚胎種植效率更高，TLM可能對胚胎的選擇起了正效應(yīng)。但是，需要進一步擴大和平衡樣本數(shù)來證實此推論。

另外，考慮到不同年齡段患者胚胎生長發(fā)育的規(guī)律和模式不盡相同。本文進一步將患者按年齡分層，分為<35歲組和≥35歲組。結(jié)果，無論是在<35歲患者還是≥35歲患者，女方年齡、臨床妊娠率和種植率在兩組間均無顯著差異(P>0.05)，而平均移植胚胎數(shù)TLM組均顯著少于CMA組(P<0.05)。就移植兩個胚胎的雙胎率，盡管兩個年齡段患者間均無顯著差異(P>0.05)，但<35歲患者TLM組有上升趨勢，≥35歲患者TLM組有下降趨勢。但是≥35歲患者僅6例移植2個胚胎，因此該結(jié)果有待擴大樣本進一步研究。

本研究中，<35歲患者利用TLM選擇D3胚胎移植后，其種植率為47.7%，移植兩個胚胎后雙胎率為57.1%。但是鑒于雙胎對母嬰健康安全會產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致妊娠高血壓和早產(chǎn)等產(chǎn)科和新生兒科問題。因此，在<35歲患者，利用TLM選擇胚胎進行早期胚胎單胚胎移植具有一定可行性。但是對于≥35歲患者，TLM組種植率為34.2%，因此利用TLM篩選胚胎行早期胚胎單胚胎移植還需進一步研究。本研究中兩個年齡段患者，TLM組和CMA組臨床妊娠率和種植率均無顯著差異。但是，在降低移植胚胎數(shù)的基礎(chǔ)上，TLM能維持穩(wěn)定的臨床妊娠率，且TLM組種植率和移植兩個胚胎后的雙胎率與CMA組比較無顯著差異，但均有上升趨勢。由于本研究中TLM組和CMA組的樣本量差異較大，因此若將兩組樣本數(shù)平衡，也許統(tǒng)計學(xué)差異會顯現(xiàn)。

綜上所述，利用Time-lapse技術(shù)選擇早期胚胎，可以在顯著減少移植胚胎數(shù)的基礎(chǔ)上，維持穩(wěn)定的臨床妊娠結(jié)局。因此，認為Time-lapse技術(shù)可以在一定程度上優(yōu)選出更具發(fā)育潛能的胚胎，為早期胚胎單胚胎移植提供新方法。