取卵后第四天或第五天移植對體外受精-胚胎移植妊娠結局的影響

辛志敏，楊曉葵，余蘭，宋蕊，王芹，王樹玉

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院生殖科，北京 100026)

隨著胚胎培養基的改善，使卵裂期胚胎移植逐漸趨向于囊胚期移植。將移植日推遲到較晚的階段可以更好地進行胚胎選擇，并可能顯著提高著床率和降低多胎率[1]。在體內，胚胎在發育的第4天從輸卵管進入子宮，這個時期已被證明是哺乳動物胚胎發育的一個關鍵窗口。在這個階段，胚胎已經融合，而且也激活了自身的基因組，使精確的體內平衡控制成為可能。但是，同取卵后第五天移植相比，第四天移植的胚胎在體外少培養一天，這是否會對胚胎的篩選優化產生不利影響？因此，本文回顧性分析了第4天桑葚胚或第5天囊胚移植對妊娠結局的影響，進一步探討第4天桑葚胚移植的可行性。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年1月至2016年12月在首都醫科大學附屬北京婦產醫院生殖科行IVF-ET治療的患者資料。

納入/排除標準：(1)女方基礎FSH水平<10 U/L；(2)女方體重指數(BMI)<28 kg/m2；(3)夫婦雙方染色體檢測均正常；(4)女方無子宮畸形、子宮內膜異位癥、單側或雙側輸卵管積水及其他免疫性不孕或內分泌疾病；(5)胚胎發育天數為 D4 或 D5。

共納入182例患者的182個周期。其中桑葚胚移植組(D4 組)102個周期，囊胚移植組(D5組)80 個周期。

二、研究方法

1.控制性超排卵：按本中心常規促排卵方案進行，Gn啟動劑量根據患者年齡、基礎FSH水平、竇卵泡數和既往促排卵卵巢反應情況決定，啟動后根據卵巢反應情況調整劑量。當有1個卵泡直徑≥18 mm或2個卵泡直徑≥17 mm時注射HCG(艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)250 μg，HCG后34～36 h陰道B超引導下穿刺取卵。

2.胚胎培養與移植：卵子及胚胎的培養采用澳大利亞COOK系列序貫培養基，精液處理采用上游法。獲得的卵冠丘復合物體外培養4～6 h后行常規IVF受精，受精后16～20 h觀察原核情況，出現兩原核(2PN)為正常受精。取卵后D4或D5選擇優質桑葚胚或囊胚行胚胎移植，移植術后予以黃體支持。

3.胚胎質量評估：第4天的評分系統參照Tao等[2]評分系統標準(1～4級)：4級胚胎被認為是最好的，胚胎為幾乎完全融合的；3級胚胎呈球形，75%以上的卵裂球融合，碎片<25%；2級胚胎形狀不規則，50%左右的卵裂球融合，25%<碎片<50%；1級是最差的，1級桑葚胚顯示不到30%的卵裂球處于融合過程中，碎片>50%。最佳的桑葚胚為卵裂球融合率超過75%的胚胎，3級和4級定義為優質桑葚胚。第5天的胚胎評分參考Gardner囊胚評分系統[3]，優質囊胚定義為4BB以上的囊胚。

4.觀察指標：胚胎移植術后14 d查血β-HCG>5 U/L確定為妊娠試驗陽性。移植后35 d行B超檢查見孕囊及胎心搏動確定為臨床妊娠。

主要觀察指標及各種率的計算方法：種植率=種植胚胎數/移植胚胎數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%，異位妊娠率=異位妊娠數/臨床妊娠數×100%，流產率=(早期流產數+晚期流產數)/臨床妊娠數×100%，足月分娩率=足月分娩數/分娩周期數×100%，活產率=活產的分娩數/移植周期數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、兩組一般情況比較

兩組患者年齡、不孕年限、基礎FSH水平、Gn天數和用量、HCG日E2水平、HCG日內膜厚度和獲卵數差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者妊娠結局比較

比較兩組患者平均移植胚胎數、胚胎植入率、臨床妊娠率、流產率、活產率及足月分娩率和異位妊娠率均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

組 別周期數平均移植胚胎數胚胎植入率臨床妊娠率D4組1021.80±0.3234.52(68/197)45.09(46/102)D5組801.79±0.2835.33(53/150)48.75(39/80)組 別周期數流產率活產率足月分娩率異位妊娠率D4組10219.56(9/46)36.27(37/102)86.48(32/37)0(0/46)D5組8015.38(6/39)41.25(33/80)81.82(27/33)0(0/39)

討 論

在IVF-ET周期中，選擇最有發育潛能或整倍體的胚胎進行移植是提高臨床妊娠率的前提。序貫培養系統的發明有效地彌補了單一培養液的不足，使獲得高質量囊胚進行移植成為現實，這無疑在很大程度上提高了ART的成功率。囊胚移植改善了胚胎-子宮內膜的同步性，同時由于囊胚染色體異常比例下降，因此有更多的機會選擇合適的胚胎進行移植[4-5]。然而，至今仍缺乏有效的指標判斷卵裂期胚胎發育成囊胚的能力，即使使用目前最先進的序貫培養基，第5天胚胎移植仍然存在因胚胎發育阻滯或囊胚質量差而取消移植的潛在風險。Montag等[6]的研究表明，在發育后期沒有胚胎選擇的情況下，延長胚胎培養是無益的，囊胚移植會增加移植的周期取消率、降低累積妊娠率。

在IVF-ET周期中，大部分移植的是卵裂期胚胎或囊胚，很少嘗試第4天桑椹胚的移植。卵裂期的優質胚胎有60%可能為非整倍體，而發育到桑葚胚及囊胚的非整倍體率可降低到30%左右[7]。研究發現，在胚胎發育的早期階段即在受精第3天之前，胚胎基因組轉錄處于沉默狀態，多數胚胎的合子基因組尚未被激活[8]。而在胚胎基因組活化后，細胞凋亡系統和細胞周期檢查點才可能被激活，從而導致桑椹胚到囊胚階段嵌合體胚胎的減少。Hsieh等[9]的研究亦表明在第4天與第5天胚胎中觀察到更高的整倍體率。另外，胚胎過早暴露于子宮環境不符合生理狀態，尤其是經過卵巢刺激后高雌激素狀態的子宮內膜。在體內，胚胎是經過輸卵管進入宮腔，進入宮腔時已發育到桑椹胚階段。因此，第4天桑椹胚移植比第2天或第3天移植更接近生理過程。此時子宮的蠕動也明顯的減少，有利于胚胎的植入。由于胚胎著床發生在受精后 6～7 d，卵裂期移植的胚胎距離子宮內膜的窗口期較遠，與正常生理情況相差較大，但桑葚胚與第5天移植的囊胚時間較為接近，也可能是本研究結果妊娠率無明顯差異的原因。桑葚胚階段還有一些其他積極的方面。例如，輔助孵化更容易也更安全。因為胚胎在融合過程中有一個較大的卵周間隙，相比而言可以降低囊胚期輔助孵化的風險；與第5天相比，第4天胚胎移植可縮短在體外培養的時間，而胚胎體外培養時間的延長可能會導致基因后天修飾的異常(基因印記異常)，進而可能影響胚胎的發育及分化過程。另外，將胚胎延長培養至囊胚階段最大的問題就是囊胚發育的不可預測性，從而顯著增加了胚胎丟失的風險。在囊胚培養時不能形成可利用囊胚的胚胎，如果在桑葚胚期將其移植，其在體內環境中可能會繼續發育并成功著床[10]。

目前，胚胎形態學評分仍然是最廣泛應用的胚胎選擇方法。盡管卵裂期胚胎(第2天和第3天)和囊胚期胚胎(第5天和第6天)的分級系統已被廣泛接受，但第4天桑葚胚期的分級仍然不一致和不確定。到目前為止，關于這一階段胚胎分級的研究還很少。在20世紀早期，Tao等[2]在第4天移植桑葚胚后患者成功懷孕。Fabozzi等[11]也提出了一種桑葚胚評分系統，觀察兩個簡單的參數(融合和碎片)來檢驗桑椹胚形態是否可以預測囊胚發育和囊胚質量，結果證明第4天的胚胎選擇可以替代卵裂期或囊胚階段的選擇[12]。Tao等[2]的研究發現，移植第3天胚胎與第4天桑葚胚的妊娠率無明顯差異，且第4天胚胎持續妊娠率高于第3天[7]。對第4天和第5天單胚胎移植的研究表明：兩組之間的臨床妊娠率沒有顯著差異[13-16]，但囊胚移植有助于篩選出最具發育潛能的胚胎，單囊胚移植仍然是試管嬰兒治療領域發展趨勢。

影響IVF-ET胚胎生長與妊娠結局的因素較多，主要包括女方年齡、不孕時間、移植日子宮內膜厚度等。本研究中兩組年齡、不孕年限及移植日子宮內膜厚度等比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。獲卵數是影響IVF-ET妊娠結局的重要因素，理想的獲卵數可避免卵巢過度刺激綜合征，獲得較好的妊娠結局。本研究兩組患者獲卵數比較，差異亦無統計學意義(P>0.05)。

本研究結果表明，第4天移植組和第5天移植組的平均移植胚胎數、優質胚胎率、種植率、臨床妊娠率、活產率、足月分娩率及異位妊娠率均無顯著差異(P均>0.05)，與Li等[14]研究結果不同的是其研究顯示兩組之間足月分娩率有顯著差異(P<0.05)，兩組足月分娩率的差異可能與第4天移植組縮短胚胎體外培養時間有關，也可能是由于研究設計和選擇的患者人群之間的差異造成的。Glujovsky等[17]關于4項隨機對照試驗的Meta分析顯示，與囊胚相比，卵裂期胚胎移植的累積妊娠率顯著增加。隨著延長培養累積活產率降低的可能原因是：未形成囊胚的胚胎由于沒達到移植或冷凍標準被丟棄，但如果其在胚胎階段冷凍并在解凍后成功移植，則有臨床妊娠的可能。這意味著在體外培養中使胚胎損耗最小化可能導致更多懷孕的可能性，累積妊娠率也更高。本研究中由于部分患者尚未解凍剩余保存胚胎，我們未對納入的研究對象進行累計妊娠率的統計，考慮到如果進一步觀察隨訪，有可能得到有意義的臨床結局。

目前，單囊胚移植是一種發展趨勢[18]。本研究結果提示，第4天桑葚胚移植可能是另一種選擇，這一策略在不影響臨床妊娠率的情況下，具有第4天或第5天移植的靈活性。如果由于部分患者自身的特殊情況或者第5天移植會造成IVF實驗室的非最佳培養條件(如IVF-ET周期過多或其他囊胚培養非最優)，第4天移植桑葚胚也是一種可行的選擇。