玉米ZmcpSRP54基因可變剪接分析

關海英 何春梅 王娟 劉鐵山 董瑞 劉春曉 劉強 汪黎明

摘要：cpSRP54基因在植物葉綠體發育中發揮重要作用。本研究用生物信息學方法對玉米ZmcpSRP54蛋白進行了進化分析，利用RT-PCR方法對玉米ZmcpSRP54基因全長cDNA進行了克隆，進而對其進行可變剪接分析。結果表明，玉米ZmcpSRP54蛋白與其它7個物種的cpSRP54蛋白有很高的相似性。鑒定到玉米ZmcpSRP54基因25個不同轉錄本，1個為標準剪接轉錄本，其它24個為可變剪接轉錄本。24個可變剪接轉錄本共使用了17種非標準剪接位點，4種可變剪接方式，主要以可變的3′端位點、可變的5′端位點和外顯子跳躍3種可變剪接方式為主。預測出18種不同長度的ORF，編碼18種不同長度的多肽。11個多肽其保守結構域氨基酸序列發生部分缺失，6個多肽其保守結構域氨基酸序列發生全部缺失，1個編碼全新的多肽。這些結果將為玉米ZmcpSRP54基因的功能研究提供重要信息。

關鍵詞：玉米;ZmcpSRP54基因;RT-PCR;可變剪接???? 中圖分類號：S513：Q781??文獻標識號：A??文章編號：1001-4942（2019）06-0001-10

Abstract?The cpSRP54 gene plays an important role during chloroplast development in plant. In this study， the bioinformatics method was used for the evolutionary analysis of maize ZmcpSRP54 protein， the RT-PCR method was used for the cloning of full-length cDNA of maize ZmcpSRP54 gene， and then the bioinformatics methods were used for the analysis of alternative splicing. Phylogenetic analysis revealed that the maize ZmcpSRP54 protein was conserved with those cpSRP54 proteins in the other seven species. A total of 25 different transcripts of ZmcpSRP54 were obtained， and 1 was a standard splicing transcript and the other 24 were alternative splicing （AS） transcripts. A total of 17 non-standard splice sites and 4 AS forms were used for the 24 AS transcripts， and alternative 3′ splice site， alternative 5′ splice site and exon skipping were the most prevalent AS forms. A total of 18 ORFs with different lengths were predicted for these 24 AS transcripts， encoding 18 polypeptides with different lengths， and 11 of which had part of the amino acid sequences in the conserved region deleted， 6 of which had all of the amino acid sequences in the conserved region deleted， while 1 of which encoded another new polypeptide. These results would provide important information for the functional study of the ZmcpSRP54 gene in maize.

Keywords?Maize; ZmcpSRP54 gene; RT-PCR; Alternative splicing

cpSRP54（chloroplast signal recognition particle 54）是cpSRP（cpSRP54，cpSRP43，cpFtsY和ALB3）途徑的重要成員之一，在葉綠體發育中發揮重要作用，該蛋白與其它3個成員相互作用將捕光葉綠素蛋白（LHCPS）從葉綠體基質轉運到內囊體膜上[1，2]。擬南芥和水稻中的cpSRP54基因突變后其葉綠體發育均受阻，葉片葉綠素含量顯著下降導致植株葉片顏色呈現淺綠色[3-5]。其中水稻ygl14（t）突變體是由于第1個內含子與第2個外顯子交界處的第2個堿基A變為T，導致OscpSRP54第一內含子保留，造成氨基酸錯譯而引起植株葉片顏色發生變異[3]。

可變剪接（alternative splicing，AS）是指一個前體mRNA選擇不同的剪接方式（通過不同的內含子剪切和外顯子連接方式）產生多種mRNA結構的過程[6]。可變剪接是一種關鍵的轉錄后調控機制，能使一個基因產生多個轉錄本和蛋白異構體，豐富了蛋白質的多樣性，也增加了其功能的復雜性[6-8]。前人研究表明，人體基因中約有95%以上都存在可變剪接[9]。1989年，在擬南芥和菠菜中發現1， 5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶活化酶（rubsicoactivase）基因發生可變剪接[10]。后經過20多年的研究發現，可變剪接是調控植物基因表達的重要方式[11]，參與植物的很多生理代謝過程、信號轉導以及對外界生物和非生物脅迫的響應[12-17]。植物基因中大約60%都存在可變剪接[12]。可變剪接方式主要包括外顯子跳躍（exon skipping，ES）、內含子保留（intron retention，IR）、可變的5′端位點（alternative 5′splice site，A5SS）、可變的3′端位點（alternative 3′ splice site，A3SS）、互斥外顯子（mutually exclusive exon，MEX）等5種基本剪接方式[18]。植物中最多的剪接方式是內含子保留[19-22]。

用水稻OscpSRP54基因序列在玉米中進行同源比對發現玉米ZmcpSRP54基因位于10號染色體上，DNA全長7 526 bp（GRMZM2G113093，B73_RefGen_v3，http：//www.maizegdb.org）。該基因有4個不同的轉錄本（GRMZM2G113093_T01和GRMZM2G113093_T02，B73_RefGen_v3;Zm00001d023431_T001和Zm00001d023431_T002，B73_RefGen_v4，http：//ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index），其中3個轉錄本（GRMZM2G113093_T01、Zm00001d023431_T001和Zm00001d023431_T002）包括15個外顯子和14個內含子，1個轉錄本（GRMZM2G113093_T02）包括10個外顯子和9個內含子。4個轉錄本編碼3種不同長度的多肽，分別包含556（GRMZM2G113093_T01和Zm00001d023431_T001）、351（GRMZM2G113093_T02）和564（Zm00001d023431_T002）個氨基酸。為了進一步研究該基因是否還有其它可變剪接轉錄本，本研究通過RT-PCR方法對ZmcpSRP54基因全長cDNA進行克隆，并利用生物信息學軟件探索其可變剪接方式，以期為進一步研究玉米及其它物種中該基因的可變剪接機制以及深入研究該基因的功能提供參考依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料 ? ?試驗所用材料是玉米自交系B73，種植于山東章丘龍山基地。開花期取穗位葉，快速置于液氮中速凍，置-80℃冰箱貯存，用于后續RNA提取。

1.2?多序列比對及進化分析 ? 將ZmcpSRP54蛋白序列通過NCBI 數據庫進行BLAST比對分析，下載其他物種的同源蛋白序列。利用DNAMAN 5.2.2軟件進行多重氨基酸序列比對。利用MEGA 7.0.14 軟件對該基因和其他物種來源的同源基因進行氨基酸序列分析，并利用鄰接法（NL） 構建系統進化樹

1.3?RNA提取及第一鏈cDNA獲得 ? ? 將玉米葉片組織用液氮研磨至粉末，取100 mg利用RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取RNA。通過NanoDrop 2000分光光度計和1%瓊脂糖電泳檢測RNA純度和濃度，取約4 μg RNA利用反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）反轉錄獲得第一鏈cDNA。所得第一鏈cDNA稀釋4倍后用于后續RT-PCR擴增。

1.4?RT-PCR擴增、測序與可變剪接分析 ? 利用Primer Premier 5.0軟件設計擴增ZmcpSRP54基因cDNA全長引物（F： 5′- CTGCTCCCGTACCTCGTCTC-3′; R： 5′- TCCGAGCCCAAGTCCCTAA-3′）。RT-PCR 反應體系（20 μL）： TksGflexTM DNA Polymerase （TAKARA，大連）0.3 μL，正反向引物各0.75 μL，模板2 μL，2×TksGflex Buffer 10 μL，加ddH2O補足體系。反應程序：95℃預變性5 min;95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸2 min，共32 個循環，結束反應。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。PCR產物經回收純化后連接pEASY-Blunt載體（全式金，北京），轉化大腸桿菌（Escherichia coli）感受態細胞DH5α（全式金，北京），挑取單克隆進行PCR陽性鑒定。將鑒定的陽性單克隆進行測序（英濰捷基，北京），獲得全長序列。利用Splign（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi）、DNAStar（http：//www.dnastar.com）和BioXM 2.6 軟件（http：//bioxm.software.informer.com/）對這些序列進行比對、外顯子/內含子結構分析、ORF預測和編碼氨基酸長度分析等。

2?結果與分析2.1?ZmcpSRP54基因進化分析

用ZmcpSRP54蛋白序列在NCBI網站進行BLASTP，搜索高粱、谷子、黍子、水稻、烏拉爾圖小麥、二穗短柄草和擬南芥等物種相應蛋白質序列，利用DNAMAN 5.2.2和MEGA 7.0.14 軟件進行多序列比對和構建進化樹。由圖1可見，玉米ZmcpSRP54蛋白PBK10867結構域（信號顆粒識別蛋白）氨基酸序列與其它物種cpSRP54蛋白相應氨基酸序列有很高的相似性。由圖2可見，玉米ZmcpSRP54與單子葉植物包括高粱SbcpSRP54、谷子SicpSRP54、黍子PhcpSRP54、水稻OscpSRP54、烏拉爾圖小麥TucpSRP54和二穗短柄草BdcpSRP54聚為一個分支，雙子葉植物擬南芥AtcpSRP54聚為另一個分支。與玉米ZmcpSRP54親緣關系最近的是高粱SbcpSRP54，其次為谷子SicpSRP54，其余親緣關系由近到遠依次是黍子PhcpSRP54、水稻OscpSRP54、烏拉爾圖小麥TucpSRP54、二穗短柄草BdcpSRP54和擬南

這些結果表明cpSRP54蛋白在植物中是保守的。2.2?RT-PCR擴增獲得ZmcpSRP54基因25個轉錄本

利用設計的擴增ZmcpSRP54基因cDNA全長引物，以玉米自交系B73葉片cDNA為模板進行RT-PCR擴增，發現擴增條帶不單一，有多條亮度強弱不等及片段大小不等的條帶（圖3）。Maizegdb（http：//www.maizegdb.org）和Gramene（http：//ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index）網站報道該基因有4個轉錄本，我們推測該基因可能有多個轉錄本。將PCR產物回收純化后連接克隆載體，64個單菌落經PCR鑒定后得到61個陽性單克隆，將鑒定的陽性單克隆送測序公司測序。所得序列經生物信息學軟件分析發現共有25種不同轉錄本（圖3B，表1），分別命名為AS1～AS25，除AS2與GRMZM2G113093_T01相同外，其余24種屬于新轉錄本（A1和A3～A25）。9個克隆所測序列是AS2轉錄本（14.75%，所占比例最高），其又與GRMZM2G113093_T01相同，推測其為標準剪接方式，其它24個轉錄本（共52個克隆）為非標準剪接方式。

2.3?ZmcpSRP54基因24個新轉錄本可變剪接分析???? 以AS2轉錄本為參照，分析其它24個轉錄本的可變剪接方式，結果見表2。24個新轉錄本主要有4種可變剪接方式，包括外顯子跳躍、內含子保留、可變的5′端位點和可變的3′端位點。1個轉錄本（AS4，3個可變剪接克隆）僅使用外顯子跳躍一種可變剪接方式;6個轉錄本（AS3、AS5、AS6、AS7、AS8和AS9，共17個可變剪接克隆）聯合使用可變的3′端位點和可變的5′端位點兩種可變剪接方式;1個轉錄本（AS24，1個可變剪接克隆）聯合使用可變的3′端位點和外顯子跳躍兩種可變剪接方式;13個轉錄本（AS11、AS12、AS13、AS14、AS15、AS16、AS17、AS18、AS19、AS21、AS22、AS23和AS25，共27個可變剪接克隆）聯合使用可變的3′端位點、外顯子跳躍和可變的5′端位點這三種可變剪接方式;1個轉錄本（AS1，1個可變剪接克隆）聯合使用可變的3′端位點、可變的5′端位點和內含子保留三種可變剪接方式;1個轉錄本（AS20，2個可變剪接克隆）聯合使用可變的3′端位點、外顯子跳躍和內含子保留三種可變剪接方式;1個轉錄本（AS10，1個可變剪接克隆）聯合使用可變的3′端位點和可變的5′端位點兩種可變剪接方式，同時其第1外顯子內部發生42 bp的剪切形成一個新的內含子（表1、表2）。本研究鑒定到的24種可變剪接轉錄本所使用的4種可變剪接方式中，主要是以可變的3′端位點（23個可變剪接轉錄本AS1、AS3、AS5、AS6、AS7、AS8、AS9、AS10、AS11、AS12、AS13、AS14、AS15、AS16、AS17、AS18、AS19、AS20、AS21、AS22、AS23、AS24和AS25，共49個可變剪接克隆），可變的5′端位點（21個可變剪接轉錄本AS1、AS3、AS5、AS6、AS7、AS8、AS9、AS10、AS11、AS12、AS13、AS14、AS15、AS16、AS17、AS18、AS19、AS21、AS22、AS23和AS25，共46個可變剪接克隆）和外顯子跳躍（16個可變剪接轉錄本AS4、AS11、AS12、AS13、AS14、AS15、AS16、AS17、AS18、AS19、AS20、AS21、AS22、AS23、AS24和AS25，33個可變剪接克隆）三種可變剪接方式為主。???? 24個可變剪接轉錄本共使用了17種非標準可變剪接位點：①5′-CC..AG-3′（AS1，1個可變剪接克隆）;②5′-CA..AC-3′（AS3、AS7和 AS10，共7個可變剪接克隆）;③5′-CT..AC-3′（AS5，2個可變剪接克隆）;④5′-TA..CT-3′（AS6，4個可變剪接克隆）;⑤5′-CT..AG-3′（AS8和AS19，共7個可變剪接克隆）;⑥5′-GC..GA-3′（AS9，2個可變剪接克隆）;⑦5′-CT..TC-3′（AS10，1個可變剪接克隆）;⑧5′-CG..AG-3′（AS11，2個可變剪接克隆）;⑨5′-CC..GG-3′（AS12，3個可變剪接克隆）;⑩5′-CC..TT-3′（AS13和AS25，共4個可變剪接克隆）;5′-GC..GG-3′（AS14，3個可變剪接克隆）;5′-GC..TT-3′（AS15和AS17，共5個可變剪接克隆）;5′-CA..AG-3′（AS16和AS22，共2個可變剪接克隆）;5′-TC..AG-3′（AS18，1個可變剪接克隆）;5′-AT..AC-3′（AS20和AS24，共3個可變剪接克隆）;5′-GA..AG-3′（AS21，2個可變剪接克隆）;5′-AC..GG-3′（AS23，1個可變剪接克隆）。AS10轉錄本（1個可變剪接克隆）使用了兩種非標準可變剪接位點②5′-CA..AC-3′和⑦5′-CT..TC-3′;AS4轉錄本（3個可變剪接克隆）只是將第2外顯子剪切，未使用非標準剪接位點;其它22個轉錄本（共48個可變剪接克隆）均只使用一種非標準可變剪接位點。???? 從可變剪接發生的位置與外顯子相關來看，與第2外顯子有關的轉錄本最多（全部24個可變剪接轉錄本），8個轉錄本第2外顯子5′端被部分剪切（AS1、AS3、AS5、AS6、AS7、AS8、AS9和AS10，共19個可變剪接克隆），其余16個轉錄本第2外顯子全部被剪切（共33個可變剪接克隆）;其次是第1外顯子（除AS4外的其余23個可變剪接轉錄本），AS20、AS24和AS25轉錄本第1外顯子全部被剪切（共4個可變剪接克隆），AS10轉錄本第1外顯子內部被剪切42 bp形成新內含子，其余19個轉錄本第1外顯子3′端被部分剪切（共44個可變剪接轉錄本）;最少的是第15外顯子，只有AS25轉錄本第15外顯子5′端被部分剪切。從可變剪接發生的位置與內含子相關來看，只有第5內含子部分保留（AS1）和第14內含子全部保留（AS1和AS20）。

24種可變剪接轉錄本預測的最長ORF均比AS2轉錄本的ORF短（表2），其長度短的主要原因有5種：①起始密碼子ATG和終止密碼子TGA位置均未發生改變，中間區段被部分剪切（AS6，AS7，AS8，AS13，AS16，AS17和AS21，共18個可變剪接克隆）;②起始密碼子ATG位置未發生改變，終止密碼子TGA（TAG）向前移動（AS18，AS19和AS22，共6個可變剪接克隆）;③起始密碼子ATG向后移動，終止密碼子TGA位置未發生改變（AS3，AS4，AS5，AS9，AS10，AS11，AS12，AS14，AS15，AS23和AS24，共24個可變剪接克隆）;④起始密碼子ATG向后移動，終止密碼子TGA向前移動（AS1和AS20，共3個可變剪接克隆）;⑤起始密碼子ATG和終止密碼子TGA均向后移動至原來ORF后，形成全新ORF（AS25，1個可變剪接克隆）。24種轉錄本預測的18種不同長度ORFs預測編碼18種長度不等的多肽，分別包括513（AS6）、512（AS7）、491（AS8）、452（AS3、AS4、AS5、AS9和AS10）、417（AS13）、351（AS12和AS14）、397（AS11）、333（AS1）、230（AS16）、194（AS15）、105（AS17）、62（AS18）、52（AS21）、42（AS24）、38（AS19和AS23）、25（AS22）、24（AS20）、5（AS25）個氨基酸（圖4）。24種可變剪接轉錄本編碼的多肽其保守結構域氨基酸序列發生部分缺失或完全缺失（圖4）。多肽P-513缺失43個氨基酸（37～79位），后5個氨基酸位于保守結構域;多肽P-512缺失44個氨基酸（38～81位），后7個氨基酸位于保守結構域;多肽P-491缺失65個氨基酸（14～78位），后4個氨基酸位于保守結構域;多肽P-452缺失104個氨基酸（1～104位），后30個氨基酸位于保守結構域;多肽P-417缺失139個氨基酸（58～196位），后122個氨基酸位于保守結構域;多肽P-397缺失159個氨基酸（1～159位），后85個氨基酸位于保守結構域;多肽P-351缺失205個氨基酸（1～205位），后131個氨基酸位于保守結構域;多肽P-333缺失223個氨基酸（1～205位;539～556位），缺失的205個氨基酸其后131個氨基酸位于保守結構域，538位氨基酸提前終止;多肽P-230缺失326個氨基酸（6～331位），后257個氨基酸位于保守結構域;多肽P-194缺失362個氨基酸（1～362位），后288個氨基酸位于保守結構域;多肽P-105缺失451個氨基酸（15～465位），后391個氨基酸位于保守結構域;其它6個多肽（P-62，P-52，P-42，P-38，P-25和P-24）保守結構域氨基酸序列全部缺失;P-5是由于AS25在3′UTR形成短的ORF編碼的全新的多肽。

3?討論與結論

Maizegdb和Gramene網站報道ZmcpSRP54基因有4個轉錄本，GRMZM2G113093_T01，GRMZM2G113093_T02，Zm00001d023431_T001和Zm00001d023431_T002。本研究通過RT-PCR擴增及測序獲得了ZmcpSRP54基因的25個轉錄本，通過分析發現AS2與GRMZM2G113093_T01相同，沒有鑒定到GRMZM2G113093_T02，Zm00001d023431_T001和Zm00001d023431_T002這3個轉錄本，可能是這幾個轉錄本的表達量比較低，沒有被克隆到。植物中可變剪接方式以內含子保留為主[19-22]，外顯子跳躍出現的頻率最低[12]。本研究鑒定到的4種可變剪接方式，主要以可變的3′端位點、可變的5′端位點和外顯子跳躍三種可變剪接方式為主，植物中一個轉錄本也會同時聯合使用兩個及以上可變剪接方式[23]。本研究發現23個（24個可變剪接轉錄本中除AS4外）可變剪接轉錄本同時使用兩種及以上可變剪接方式，如果這也是普遍存在的，就會顯著增加轉錄后加工的復雜性。植物內含子序列的識別位點具有高度保守性，約99.24%的剪接位點符合GT-AG規則[24]，有的還遵循AT-AC規則[25]。本研究24個可變剪接轉錄本除了使用GT-AG和AT-AC規則外，還使用其它16種非標準剪接位點。

本研究鑒定到的25個轉錄本預測編碼19個長度不同的多肽，除AS2轉錄本編碼的多肽P-556與GRMZM2G113093_T01和Zm00001d023431_T001編碼的多肽相同，AS12和AS14轉錄本（AS12和AS14轉錄本與GRMZM2G113093_T02序列不同）編碼的多肽P-351與GRMZM2G113093_T02編碼的多肽相同，其它17個為新的多肽。除P-556外的18個多肽中，11個多肽其保守結構域氨基酸序列發生部分缺失， 6個多肽保守結構域氨基酸序列發生全部缺失，還有1個長度只有5個氨基酸的全新多肽。保守結構域氨基酸序列發生部分缺失的11個多肽是否具有生物學功能，以及其它6個保守結構域氨基酸序列發生全部缺失的多肽及全新多肽P-5是否完全喪失生物學功能，仍然有待進一步研究。本研究發現的多個可變剪接體也為進一步研究玉米ZmSRP54蛋白功能提供了重要信息。

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