桑樹中miR319的克隆及在雄花發育中表達分析

孫志超 李 娜 謝 巖 楊 帆 高妍夏 高玉軍 楊貴明 李季生

(河北省高校特產蠶桑應用技術研發中心/承德醫學院蠶業研究所,河北承德 067000)

MicroRNA(miRNA)是一類長度為20 ～24 nt 的內源性、非編碼小分子RNA(small RNA,sRNA),通過降解和抑制靶基因表達[1-2],參與植物器官的形態建成[3]、激素應答[4]、營養代謝等一系列生物學過程[5-6]。在植物約20 個保守的miRNA 家族中,miR319 與植物花器官的生長發育密切相關,并參與調控部分植物激素載體蛋白,從而調控植物激素合成及參與重要信號途徑[7]。研究表明,miR319 主要靶向于TCP 轉錄因子,此外,miR319 也能調控一些MYB 轉錄因子。Nag 等[8]在擬南芥中的研究表明,miR319a 突變體會導致花發育過程中花瓣、雄蕊等缺陷;進一步研究miR319a 與tcp4 突變體中的miR319a 及其5 個靶基因的表達發現,TCP4 基因是miR319a 的5 個靶基因中的主要靶向目標,且miR319a 靶向調控的TCP4 基因表達水平在花發育尤其是花瓣和雄蕊發育中起著關鍵作用。Palatnik 等[9]研究表明,miR319 調控MYB33和MYB65 轉錄因子從而影響植物雄蕊育性,miR319a過表達引起雄蕊敗育以及雄蕊變短、育性降低等現象,這可能是由于miR319a 過表達導致MYB33 與MYB65降解引起的。Nicolas 等[10]研究表明茉莉酸(jasmine acid,JA)信號途徑參與花瓣的生長、雄蕊伸長和花粉成熟。閆志強等[11]研究表明,JA 類植物激素具有誘導禾本科植物穎花開放的功能。Hao 等[12]和Rubiosomoza 等[13]在擬南芥中發現,TCP 轉錄因子通過調控JA 生物合成關鍵酶基因LOX 從而控制JA 生物合成。

桑樹(Morus alba L.)除用于絲綢業生產外,其葉、嫩枝和根皮已在中國、日本及其他許多國家被廣泛運用于藥用。隨著經濟的發展,桑產業正從東南經濟發達地區向內陸地區逐步擴大[14]。利用傳統育種技術在一定程度上可以篩選出優良林木品種,但很難在短時間內聚合多個優良的目標基因,而利用基因工程技術可以快速提高育種進程[15]。目前,有關桑樹miR319 在花發育過程中的應答機制及其靶基因的表達模式研究尚未見報道。本研究基于高通量測序發掘桑樹miR319,在川桑基因組中預測miR319 的前體序列及靶基因,采用PCR 技術在桑樹物45 中對2 個前體序列進行克隆及測序;利用5′-RACE 對靶基因進行驗證;采用RT-qPCR 獲取miR319,靶基因及JA 合成關鍵基因在物45 雄花發育不同階段表達特征,以期為進一步研究miR319-mRNA 在桑樹花發育過程中的機制和功能提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以河北省承德市承德醫學院蠶業研究所桑園為試驗區,桑樹品種為物45,從2017年5月26日-6月13日每隔5 d 采集桑樹雄花一次,所有樣品均來自同一棵樹,采集的樣品立即置液氮速凍,-80℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 雄花材料的固定與石蠟切片 將采集的樣品立即放入4%多聚甲醛中固定,4℃過夜(24 h)。然后用酒精、磷酸緩沖液混合液梯度脫水。脫水完成的材料轉入二甲苯、酒精混合液(二甲苯∶酒精體積比為1 ∶1)和純二甲苯進行透明,時間為1 h。透明結束的材料倒去舊的二甲苯,加入石蠟、二甲苯混合液置換,石蠟∶二甲苯體積比為1 ∶1,2 h,將材料轉入純石蠟中浸蠟3 次,每次2 h。材料被切成6 μm 厚度的蠟帶,置于專用載玻片上。花芽石蠟切片浸入二甲苯中脫蠟2次,每次處理10 min,乙醇梯度處理。切片用蘇木精和伊紅染色,然后用乙醇脫水,用100%二甲苯滲透,并用中性樹脂覆蓋,在BX51T 顯微鏡(OLYMPUS,日本)下觀察并拍照。

1.2.2 RNA 的提取和cDNA 的合成 利用試劑盒(TaKaRa,日本)提取物45 雄花芽總RNA。用Nano Drop ND-2000 分光光度計(Thermo Fisher,美國)檢測RNA 的濃度和純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。按照反轉錄試劑盒(TaKaRa,日本)說明書合成cDNA。合格的RNA 樣品于-80°C 保存備用。

1.2.3 miR319 前體序列克隆與靶基因5′-RACE 驗證 miR319 的前體序列使用在線網站RNAfold (http：/ /www.tbi.univie.ac.at/ ～ivo/RNA/ViennaRNA-1.8.1.tar.gz)在川桑基因組中預測,對預測后的結果進行篩選。用Primer Premier 5 軟件設計引物(表1),參照PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 使用說明擴增前體序列。使用在線網站psRNATarget(http：/ /plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis? function= 3)預測桑樹miR319 家族在川桑基因組中的靶基因[16]。利用5′-RACE 技術進行靶基因驗證[17],在miR319 與預測到的靶基因互補位點下游設計2 條5′-RACE 下游特異性引物(表1),采用GeneRacer Kit(Invitrogen,美國)在RNA 5′端加上寡核苷酸接頭后用Oligo(dT)反轉錄成cDNA。cDNA 稀釋10 倍后利用試劑盒中通用引物和設計的特異性引物對每個基因進行PCR 擴增,擴增產物用快速瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒[生工生物(上海)有限公司]回收,并連接到pMD18-T(TaKaRa,日本),轉化到E. coli DH5a 感受態細胞(TaKaRa,日本)中,涂板后37℃過夜培養,挑選單克隆送至上海生工生物有限責任公司測序。

表1 miR319 前體序列克隆與靶基因5′-RACE 引物Table 1 Primer of miR319 precursor sequence and its targets for clone and 5′-RACE

1.2.4 實時熒光定量PCR 采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit 試劑盒(TaKaRa,日本)將物45 不同發育階段雄花芽提取RNA 反轉錄成cDNA 作為實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應模板。使用頸環法,檢測miR319a 的表達,反轉錄引物為：5′-GTCGTATCCAGTG CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCACG T-3′。RT-PCR 試劑盒為TaKaRa(日本)公司生產的SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ。以U6 為miRNA 內參基因,以Ribosomal protein L15 為mRNA 內參基因,miR319、靶基因和內參基因各引物序列組成詳見表2。相對表達量計算采用2-△△Ct法[18]。

1.2.5 JA 含量的測定 JA 含量采用ELISA 試劑盒(上海仁捷生物有限公司)測定。

表2 基因的RT-qPCR 引物Table 2 List of RT-qPCR primer sequences used for genes

2 結果與分析

2.1 桑樹雄花芽組織學觀察

組織學分析將花芽發育分為4 個不同的階段,從頂端分生組織開始到單個小花出現(圖1)。相鄰發育階段的間隔時間為5 d。在第一階段,花芽分生組織由頂端分生組織和一些葉原基組成,為未分化期(A1)(圖1-A1)。花序原基開始發育被定義為分化初期(A2)(圖1-A2)。花絮長大,為花序分化期(A3)(圖1-A3)。在第四階段花序中可以觀察到單個花朵,為總苞形成期(A4)(圖1-A4)。

2.2 桑樹miR319 前體序列的克隆與分析

在桑樹中共預測到3 個miR319 家族成員,分別為miR319a、miR319b 和miR319c。通過序列比對發現miR319b 與擬南芥 miR319a/miR319b 序列一致,miR319a/miR319c 與擬南芥miR319c 在序列的第1 個和最后1 個堿基存在差異(圖2-A)。使用PCR 技術對3 個miRNA 前體進行克隆并測序(miR319b 與miR319c 位于同一前體位置上),以物45 總RNA 反轉錄的cDNA 為模板,結果顯示,miR319a 與miR319c 前體擴增分別位于104 bp 與199 bp 位置上。產物連接至PMD18-T 載體進行測序,結果表明miR319a 與miR319c 擴增片段與預測的序列一致(圖2-B)。

2.3 miR319 靶基因預測及5′-RACE 技術驗證

利用在線網站psRNATarget 預測桑樹miR319 家族在川桑基因組中的靶基因。miR319a 預測到6 個靶基因,miR319b 預測到4 個靶基因,miR319c 預測到5個靶基因(圖3-A)。使用5′-RACE 技術驗證桑樹中預測的6 個靶基因,結果顯示所預測到的Morus012208(MYB)、Morus008229(MYB)、Morus008100(MYB)和Morus005893(TCP2)4 個靶基因為miR319a 有效靶基因,且切割位點出現在與miRNA 互補序列的第10 ～第11 個堿基之間(圖3-B)。

2.4 桑樹雄花芽發育過程中JA 含量變化及miR319a 表達分析

采用試劑盒測定JA 在雄花發育過程中的含量變化,JA 在A1-A2 階段其含量變化不明顯,在A2-A4 時期表達水平迅速上升(圖4-A)。利用RT-qPCR 技術檢測桑樹miR319a 在此過程中的表達發現,miR319a在桑樹雄花芽發育A1-A2 階段表達上升,在A2-A4 階段表達下降(圖4-B)。

2.5 桑樹雄花芽發育過程中miR319a 靶基因表達分析

圖1 花芽發育早期組織學觀察Fig.1 Histology of early flower bud development

圖2 miR319 成熟體序列比對及前體序列擴增Fig.2 Sequence alignment of the mature miR319 and amplification of miR319 precursor

圖3 miR319 靶基因預測及5′-RACE 技術驗證Fig.3 miR319 target genes predicted determined by 5′-RACE

圖4 桑樹雄花發育過程中JA 含量變化(A)及miR319a 表達分析(B)Fig.4 Analysis of JA content(A) and miR319a expression level(B) during male flower development in mulberry

對miR319a 靶基因在雄花發育過程中進行定量分析。結果表明,Morus012208 在A1-A2 階段表達降低,A2-A4 階段表達水平呈上升趨勢,與miR319a 呈相反的表達模式。Morus008229 在A1-A3 階段表達水平呈上升趨勢,在A4 階段略有下降。Morus023872 與Morus010305 呈相同的表達模式,均為A1-A2 階段表達水平上升,A2-A3 階段表達水平下降,A3-A4 階段表達水平再次上升,A1-A3 階段與miR319a 呈現相同的表達模式。Morus008100 與Morus005893 呈現相同的表達模式,均在A1-A2 階段表達水平下降,A2-A3 階段表達水平上升,A3-A4 階段表達水平再下降,A1-A3階段與miR319a 呈相反的表達模式(圖5)。

2.6 桑樹雄花芽發育過程中JA 合成關鍵基因表達分析

RT-qPCR 結果表明,JA 合成關鍵基因PLDα1 與LOX5 在桑樹雄花芽發育A1-A3 階段表達水平上升,A3-A4 階段表達水平下降。而AOS 表達水平則呈現A1-A2 階段上升、A2-A3 階段下降、A3-A4 階段上升的波動趨勢(圖6)。

3 討論

miRNA 作為基因表達的上層調節因子,其介導的基因沉默在植物花發育過程中發揮著重要的調節作用[19]。有研究表明在山核桃、梅花等植物花芽發育過程中,均能引起內源性miRNA 特定表達[5,20-21]。大量研究表明,miR172 與miR156 對花期的調控作用明顯,二者對花型的調控也有一定的作用[22-24]。如miR172在花發育的早期起到關鍵作用,miR172 抑制AP2 表達,使花瓣數目減少[24]。miR319 及其靶基因TCP 在植物中較保守,miR319 靶向作用TCP4 調控植物花器官的生長發育[8]。

本研究在桑樹中共預測到3 個miR319 家族成員(miR319a、miR319b 和miR319c),其中miR319b 與miR319c 位于同一前體位置上,使用PCR 技術驗證與所預測的前體序列一致。通過全基因組檢索預測到Morus012208、Morus008229、Morus023872、Morus010305、Morus008100 與Morus005893 屬于桑樹miR319 靶基因,并通過5′-RACE 在桑樹物45 中驗證miR319 可靶向于 Morus012208、Morus008229、Morus008100 與Morus005893 基因,且切割位點均出現在與miRNA 互補序列的第10 ～第11 個堿基之間。在擬南芥中miR319 切割TCP/MYB 基因位點與桑樹中切割位點序列一致,miR319 與靶基因的互補位點及剪切位點在不同物種間保守性較強[25-26]。這種進化的保守性表明,這些作用位點發揮著重要的生物學功能[25,27]。

本研究通過石蠟切片技術判斷了桑樹雄花發育的4 個關鍵時期,未分化期(A1)、分化初期(A2)、花序分化期(A3)和總苞形成期(A4)。利用RT-qPCR 發現,在桑樹雄花發育花序分化期(A2-A3)miR319 表達明顯下 降, 靶基因 Morus012208、Morus008229、Morus008100 和Morus005893 與miR319 表達呈相反的模式,表明miR319 在此階段負調控靶基因的表達影響桑樹雄花花序分化。miR319 靶向基因TCPs 參與JA 合成系統和動態平衡[28]。在擬南芥中TCP 在轉錄水平上促進或抑制LOX、PLDα1 和AOS 的表達[28]。LOX、PLDα1 和AOS 也是JA 合成系統中的關鍵基因[29-30]。本研究中LOX5 和PLDα1 在A2 和A3 階段表達升高,與miR319 靶基因表達趨勢一致,表明JA合成關鍵基因LOX5 和PLDα1 可能受到TCP 的調控。因此,推測miR319 可能通過影響JA 的合成影響桑樹雄花花序分化。

4 結論

圖5 桑樹雄花芽發育過程中miR319a 靶基因表達分析Fig.5 Expression analysis of the targets of miR319a during male flower development in mulberry

圖6 桑樹雄花芽發育過程中JA 合成關鍵基因表達分析Fig.6 Expression profiles of the key genes of JA during male flower development in mulberry

本研究通過生物信息學方法,在桑樹中鑒定到3個miR319,并在桑樹物45 中克隆了前體序列;對3 個miR319 成員進行了靶基因預測,miR319a 預測到6 個靶基因,miR319b 預測到4 個靶基因,miR319c 預測到5 個靶基因,并采用5′-RACE 技術鑒定到了4 個基因( Morus012208、Morus008229、Morus008100 與Morus005893)為其有效靶基因。利用RT-qPCR 技術分析miR319 及6 個靶基因的表達模式,在雄花發育A2-A3 階段,miR319a 表達水平迅速降低,靶基因Morus012208、Morus008229、Morus008100 和Morus005893表達水平迅速升高,JA 合成關鍵基因LOX5 和PLDα1表達水平升高,JA 含量也迅速升高。表明,在桑樹雄花花序分化過程中miR319 可能通過調控靶基因影響JA 含量來行使生物學功能。本試驗結果為桑樹miR319 在雄花發育過程中的作用機制的研究提供了一定的理論依據。