辣椒BES1基因家族鑒定及表達分析

孟純陽 魏小春 趙艷艷 原玉香 王志勇楊雙娟 姜 俊 張曉偉,?

(1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,河南鄭州 450002;2鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450001;3駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 河南駐馬店 463000)

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids,BRs)又稱蕓薹素內(nèi)酯,是一種天然植物激素,主要存在于植物的花粉、種子、莖、葉等器官中,廣泛參與植物各種生長調(diào)節(jié)過程,如莖伸長、葉發(fā)育、花粉管生長、木質(zhì)部分化、衰老、光形態(tài)發(fā)生、脅迫響應(yīng)等[1-2]。Li 等[3]對擬南芥油菜素內(nèi)酯生物合成突變體進行分子鑒定,發(fā)現(xiàn)這些有缺陷的突變體表現(xiàn)出下胚軸和葉柄變短、頂端顯性和雄性不育減弱、衰老和開花延緩以及在黑暗中去黃化等表型,進一步證明油菜素內(nèi)酯對正常植物生長發(fā)育具有重要作用。

BES1 是一種植物特異性轉(zhuǎn)錄因子,可以與BR響應(yīng)基因結(jié)合并進行調(diào)節(jié)。研究表明,BZR1 和BES1 是2 種密切相關(guān)的核蛋白,且二者氨基酸序列具有較高的同源性,通過保守N 末端DNA 結(jié)合域與DNA 結(jié)合[4],并與油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因結(jié)合,調(diào)控該類基因的表達[5-7]。在BR 信號通路中BZR1 和BES1 均發(fā)揮正調(diào)控作用[8-9]。BRI1 是一種跨膜富亮氨酸重復(fù)受體激酶,可以與另一種富亮氨酸受體激酶BAK1 相互作用,它們的共受體可以在細胞表面感受BR 信號。此外,BIN2 被證實是BR 信號的負調(diào)控因子,當(dāng)缺乏BR 信號時,BZR1 和BES1 在BIN2激酶作用下主要以磷酸化形式存在, 磷酸化的BZR1可以被26S 酶體降解, 同時BES1 的磷酸化作用也受BSU1 蛋白調(diào)節(jié)[10]。上述研究表明,BR 信號通過BRI1-BAK1 受體激酶抑制BIN2 或活化BSU1,使非磷酸化的BZR1 和BES1 在細胞核中積累,從而反向調(diào)節(jié)BR 靶基因。

辣椒(Capsicum annuum L.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜作物兼經(jīng)濟作物。辣椒果實以其高營養(yǎng)價值和獨特風(fēng)味而聞名于世。2014年辣椒基因組序列已經(jīng)完成測序并公布[11-12],但關(guān)于辣椒基因的生物信息學(xué)特征和潛在作用的研究并不常見,且辣椒BES1 家族對不同脅迫的響應(yīng)研究尚鮮見報道。本研究以已測序辣椒CM334 為試驗材料,進行全基因組BES1 家族鑒定,鑒定出9 個候選BES1 基因,并對候選基因的性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化關(guān)系、時空表達特征進行分析,以期為進一步研究BES1 基因?qū)ι锘蚍巧锩{迫的表達模式奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用辣椒材料為CM334,由韓國首爾國立大學(xué)提供。辣椒培養(yǎng)條件參照魏小春等[13]的方法。當(dāng)辣椒幼苗生長至6～8 片真葉展開時分別進行相關(guān)脅迫處理。

1.1.1 不同脅迫處理 采用100 μmol·L-1脫落酸(abscisic acid,ABA)和200 μmol·L-1茉莉酸甲酯(methyl jasmona,MeJA)分別噴灑辣椒葉片的正反面,以噴灑無菌水為對照;對辣椒葉片進行高溫(heat)處理,白天溫度設(shè)置為42±2℃,夜晚設(shè)置為35±2℃;對辣椒葉片進行低溫(cold)處理,光照培養(yǎng)箱的溫度降至為5℃(晝)/0℃(夜);以300 mmol·L-1NaCl 對辣椒葉片進行鹽(Nacl)處理,并以加入無菌水處理為對照。

1.1.2 疫病處理(YB) 將辣椒幼苗的根置于用Hoagland’s 培養(yǎng)液配置好的孢子懸浮液中(病原菌來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊實驗基地),以無菌水作對照。28℃保濕24 h 后在溫度28℃、相對濕度70%～90%條件下培養(yǎng),期間每日搖晃水培盆,以補充培養(yǎng)液中的溶氧含量。以上所有處理的辣椒植株在培養(yǎng)箱中的光照強度均為160 μmol·m-2·s-1,光周期均為12 h 光照/12 h 黑暗。

1.2 方法

1.2.1 辣椒BES1 基因的鑒定 將BES1(Pfam：PF05687)保守結(jié)構(gòu)域與辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(http：/ /peppergenome.snu.ac.kr/)[14]進行BLAST 比對,獲得的所有候選序列在NCBI 進行Blastp 比對。利用在線分析工具ProtParam (http：/ /web.sxpasy.org/protparam/)分析候選氨基酸序列的等電點及分子量[15]。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析 以候選BES1 家族成員的CDS 序列和基因序列為參照,通過在線GSDS2.0(Gene Structure Display Server,http：/ /gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行基因結(jié)構(gòu)分析[16]。在此網(wǎng)站進行分析時將CDS 序列和基因序列都轉(zhuǎn)換成FASTA 格式,采用Tbtools (Toolbox for Biologists)對保守結(jié)構(gòu)域進行分析。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 采用CLUSTALW 對BES1家族蛋白序列進行多序列比對,比對后BES1 蛋白序列用MEGA7.0 軟件中的鄰近法構(gòu)建進化樹,校驗參數(shù)bootstrap 值設(shè)置為1 000 次重復(fù)。

1.2.4 辣椒BES1 基因家族表達模式分析 在(https：/ /www. nature. com/articles/ng. 2877) 中獲取CM334 RNA-seq 數(shù)據(jù),利用HemI 繪制表達熱圖并進行分析。

1.2.5 辣椒總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成 總RNA 提取按照MiniBeST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa,大連)試劑盒說明書進行。cDNA 第一鏈的合成參照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,大連)試劑盒說明書進行。

1.2.6 辣椒BES1 基因家族脅迫應(yīng)答分析 采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)(引物信息詳見表1),反應(yīng)體系為20.0 μL,包括cDNA 2.0 μL、上下游引物各1 μL、10.0 μL 2×SYBR? Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus) 以及6 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸60 s,循環(huán)40 次[13]。采用2-△△CT法[17]計算基因相對表達量。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒BES1 基因家族成員的鑒定

利用BES1_N 結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型在辣椒基因組數(shù)據(jù)庫PGP(http：/ /peppergenome.snu.ac.kr/)進行BLAST 比對,從CM334 基因組中鑒定出9 個BES1轉(zhuǎn)錄因子候選成員(表2)。9 個候選基因與遵辣一號基因組進行比對,用遵辣一號基因?qū)蜻x基因序列中有空位的進行修正。BES1 基因家族開放閱讀框大小介于546(CA10g04670) ～2 142 bp(CA08g07160)之間,編碼蛋白序列長度范圍介于181(CA10g04670)～713 個氨基酸(CA08g07160)之間,分子量介于20.22(CA10g04670)～78.23 kDa(CA08g07160)之間,等電點介于5.48(CA02g13270) ～9.23(CA04g20150)之間。

2.2 辣椒BES1 基因進化及結(jié)構(gòu)分析

由圖1 可知,9 個辣椒BES1 基因可分為ClassⅠ和ClassⅡ2 類,分別含有7 個和2 個BES1 基因。ClassⅠ中的基因均只含有1 個內(nèi)含子,ClassⅡ中的基因含有多個內(nèi)含子(8 ～10 個)。ClassⅠ和ClassⅡ組內(nèi)的結(jié)構(gòu)均高度相似。Class Ⅰ與Class Ⅱ序列差異較大,Class Ⅰ序列較短。

2.3 辣椒BES1 基因結(jié)構(gòu)域分析

由圖 2 可知, 大部分基因( CA12g12430、CA04g20150、Capana02g000043、CA07g16850、CA04g01080 和CA10g04670)都含有BES1_N 結(jié)構(gòu)域。僅CA02g13270 含有 BES1 _ N 超家族結(jié)構(gòu)域。Capana01g004209 和CA08g07160 含有PLN02905 超家族結(jié)構(gòu)域。

2.4 系統(tǒng)進化分析

為了研究辣椒BES1 蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系,用鄰近法分析了辣椒、擬南芥、甘藍、黃瓜、大豆、谷子、番茄和葡萄BES1 家族的進化關(guān)系。由圖3 可知,與辣椒BES1 基因家族關(guān)系最近的是同屬于茄科的番茄,表明在進化過程中辣椒和番茄BES1 具有較高的保守性,即可以通過已研究物種BES1 基因家族功能來推測辣椒BES1 的功能。同時發(fā)現(xiàn),單子葉植物谷子的部分BES1 基因單獨一個支,但某些BES1 基因與雙子葉植物進化關(guān)系較近,表明單子葉植物與雙子葉植物BES1基因家族在進化上既有相同之處,也存在差異。

2.5 辣椒BES1 基因時空表達分析

由圖4 可知,BES1 基因在不同組織的表達模式差異明顯,BES1 基因在葉中表達量明顯低于根和莖中的表達量。CA04g01080 在果皮發(fā)育和葉中表達量相對較低,但在根和莖中表達量高。CA07g16850 在果皮和胎座發(fā)育中表達量較低,但在莖中表達量較高。同時還發(fā)現(xiàn)CA10g04670 在各組織中不表達,整體上ClassⅠ其他成員在果皮中具有相似的表達模式。綜上,辣椒BES1 基因在不同組織中的功能可能存在差異。

2.6 辣椒BES1 基因家族脅迫應(yīng)答分析

由圖5 可知,在ABA、低溫、高溫、MeJA、YB 脅迫下,CA04g20150 和CA12g17430 的表達量均在2 h 時迅速升高, 應(yīng)激反應(yīng)強烈。在高溫脅迫下,CA04g20150 和CA12g17430 在12 h 時表達量達到最大值。在鹽脅迫下,CA04g20150 和CA12g17430 基因量在不同的時間差異不大,表明BES1 基因?qū)}脅迫不敏感。

圖1 辣椒BES1 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 The gene structure of BES1 gene family members in pepper

圖2 辣椒BES1 基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domain of BES1 gene family members in pepper

圖3 單子葉和雙子葉BES1 基因家族的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis of monocotyledon and dicotyledonous BES1 gene family

圖4 BES1 基因在CM334 不同組織中表達模式Fig.4 Expression profile of BES1 gene for different tissues in CM334

圖5 脅迫條件下辣椒BES1 基因家族2 個代表基因的表達量Fig.5 Expression of 2 representative genes of BES1 gene family in pepper under stress

3 討論

辣椒中BES1 基因在擬南芥中均能找到同源基因,而擬南芥中部分BES1 基因已經(jīng)研究得較為清楚[7],因此可以根據(jù)擬南芥BES1 基因功能推測辣椒中同源基因功能。研究表明,低等植物的BES1 轉(zhuǎn)錄因子一般較高等植物少,BES1 轉(zhuǎn)錄因子在植物進化過程中可能起到重要作用[18]。胡靜靜等[19]對甘藍型油菜BES1 基因家族進行研究,發(fā)現(xiàn)BES1 基因主要在根和葉中高表達,在生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。本研究利用已公布的CM334 基因組測序數(shù)據(jù)共鑒定出9 個BES1 基因,根據(jù)基因結(jié)構(gòu)將BES1 基因家族分為2 類,其中,大部分BES1 基因在結(jié)構(gòu)上相似,都只含有一個內(nèi)含子,并且都含有BES1_N 結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明,辣椒BES1 基因在進化上與番茄親緣關(guān)系最近。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn),辣椒BES1基因家族在根和葉中表達量較高,在辣椒果實發(fā)育過程中起著重要作用。

油菜素內(nèi)酯作為一種脅迫緩和劑,廣泛分布于植物中,以抵御高溫[20]、低溫[21]、干旱[22]、鹽[23]、除草劑[24]、昆蟲[25]、病原體[26]等脅迫。此外,BES1 能抑制BR 合成途徑中一些酶(CPD、DWF4 等)和BR 信號組分BRI1、BES1 同源基因(BEH1 和BEH2)的表達,從而反饋抑制BR 響應(yīng)[27]。研究表明,BZR 或BES1 功能缺失植株均未出現(xiàn)明顯的BR 不敏感性。通過RNA干擾技術(shù)對BES1 和BZR 轉(zhuǎn)錄水平同時抑制,導(dǎo)致BR不敏感的表型,表明BZR1、BES1 及其他家族成員之間存在局部基因冗余現(xiàn)象[4,23]。Saito 等[28]發(fā)現(xiàn)BZR1和BES1 在維管組織發(fā)育上的功能存在冗余現(xiàn)象,因此BES1 可能通過影響B(tài)R 信號通路和BR 合成,增強其對脅迫的抵抗力。本研究結(jié)果表明,BES1 基因家族在辣椒中表達具有差異性, CA04g20150 和CA12g17430 在ABA、低溫、高溫、MeJA 和YB 脅迫下明顯上調(diào)表達,表明這2 個基因在應(yīng)對脅迫時發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本研究以辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),利用生物信息學(xué)方法在轉(zhuǎn)錄組水平上對BES1 基因家族進行了鑒定和分析。結(jié)果表明,在辣椒中共鑒定得到9 個BES1基因,根據(jù)基因結(jié)構(gòu)將BES1 基因家族劃分為2 組。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,BES1 基因在辣椒不同組織中差異性表達。同時,RT-qPCR 分析發(fā)現(xiàn)BES1 基因能增強植物抵御逆境脅迫的能力。本研究為辣椒中BES1基因抵御逆境脅迫的分子機制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。