墨魚纏卵腺糖蛋白的抗氧化及抑菌活性研究

薛張芝 張洪超 丁 源 徐曉蓉 李 楊 李和生

(寧波大學食品與藥品學院,浙江寧波 315211)

墨魚纏卵腺俗稱墨魚蛋,其味道鮮美,營養豐富,富含優質蛋白,是一種高蛋白低脂肪的食品,在我國潮汕地區、日照、寧波等地已成為一種特色美食,深受人們的喜愛[1-2]。墨魚纏卵腺中的蛋白與糖結合可形成糖蛋白(glycoprotein),糖蛋白是分支的寡糖鏈與多肽鏈共價相連而成的復合糖,主鏈較短,一般情況下,糖蛋白中糖含量小于蛋白質。國內外研究學者已從河蜆[3]、扇貝[4]、章魚[5]、皺紋盤鮑[6]、魷魚[7]等海洋生物中提取了糖蛋白,發現其具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、降血脂等免疫特性。王倩等[8]在魷魚纏卵腺中提取出糖蛋白并對提取工藝進行優化,發現采用0.37 mol·L-1NaOH 在25℃條件下提取3.5 h 時,糖蛋白提取率最大,為12.79%;Shigeru 等[7]從魷魚纏卵腺中發現一種粘蛋白,鑒定其主要成分是糖蛋白,其中蛋白質含量16.4%,糖含量80.3%,硫酸酯含量3.3%,但并未對其相關活性進行深入研究;劉淑集等[9]研究了魷魚纏卵腺糖蛋白的降血脂活性及非特異性免疫功能;王春琳等[10]僅研究了墨魚纏卵腺的組織學及超微結構;戴宏杰[2]研究了墨魚纏卵腺的營養成分與評價。而有關墨魚纏卵腺糖蛋白( cuttlefish gland glycoprotein,CGG)的研究鮮見報道,本試驗對墨魚纏卵腺中糖蛋白的體內外抗氧化及抑菌特性進行研究,以期多角度開發墨魚資源,提高墨魚資源的優化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

墨魚纏卵腺購自寧波江北路林市場。鄰苯三酚、Tris-HCl 緩沖液、無水乙醇、水楊酸、磷酸緩沖液、三氯乙酸、三氯化鐵等均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

GL21MC 冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;UV-3300 型紫外分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;DNP-9162 型電熱恒溫培養箱,寧波江南儀器廠;SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司;STARTER 3C 型pH 計,奧豪斯儀器(上海)有限公司;KYC-100B 空氣恒溫搖床,寧波江南儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 CGG 提取物的制備 參考文獻[11]的方法。將新鮮墨魚纏卵腺去外層薄膜,勻漿,加入0.4 mol·L-1NaOH 提取,料液比1 ∶20,離心(8 000 r·min-1)15 min取上清液,2 倍無水乙醇進行醇沉4 h 除去醇溶蛋白和糖,MD44 透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)透析48 h 除去小分子雜質,采用DEAE-52 纖維素柱層析,收集11～20 min 時的重疊峰,凍干得糖蛋白粗品,再經SephacrylM-300HR 凝膠柱層析收集出峰流出液,凍干后得糖蛋白純品。分別配制14、7、3.5、2 mg·mL-1,糖蛋白樣液備用。

糖蛋白中總糖含量測定：采用硫酸-蒽酮法[12]。以葡萄糖標準液的質量濃度為橫坐標,以吸光值(A)為縱坐標作圖,線性回歸分析得標準曲線為y =0.004 7x-0.003 8,R2=0.999 7,按照標準曲線計算糖含量：

式中,y：墨魚纏卵腺中總糖含量;m：樣品溶液中總糖含量;M：干物料質量。

蛋白含量測定：采用考馬斯亮藍G-250 法。以牛血清清蛋白的質量濃度為橫坐標,以吸光值(A)為縱坐標作圖,線性回歸分析得標準曲線為：y=0.006 1x+0.005 6,R2=0.999 6,按照標準曲線計算蛋白含量：

式中,y：墨魚纏卵腺中蛋白含量;m：樣品溶液中蛋白含量;M：干物料質量。

1.3.2 CGG 超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[13]。取10 支試管,分別配制不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg·mL-1)的糖蛋白溶液各4 mL。以蒸餾水作空白對照,各試管中分別加入4.5 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH 值8.2)后振蕩混勻,25℃水浴20 min,然后分別加入0.3 mL 3 mmol·L-1鄰苯三酚溶液,混勻后立即測定其在320 nm 波長處的吸光度值,每隔30 s 記錄一次吸光值,計時4 min,以空白對照調零,得到吸光度隨時間變化的回歸方程。對照組為相同濃度的維生素C(Vc)溶液,按照公式計算超氧陰離子清除率：

式中,V1：空白對照組鄰苯三酚自氧化速度(ΔA/min);V2：樣品組鄰苯三酚自氧化速度(ΔA/min)。

1.3.3 CGG 的DPPH 自由基清除能力的測定 分別制備不同濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1)的樣品各2 mL,然后分別加入2 mL 0.05 mmol·L-1DPPH溶液(95%乙醇配制)振蕩均勻。樣品對照組以95%乙醇代替DPPH 溶液,空白對照組以2 mL 蒸餾水代替樣品,在517 nm 波長下測定其吸光度值[14-15],平行測定3 次。對照組為相同濃度的Vc 溶液,按照公式計算DPPH 自由基清除率：

式中,A0：空白對照組吸光度值;As： 樣品組吸光度值;Ax：樣品對照組吸光度值。

1.3.4 CGG 羥基自由基清除能力的測定 參考Fenton 反應法[16]分別制備不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg·mL-1)的樣品各1 mL,分別依次加入2 mL 1.8 mmol·mL-1FeSO4溶液、1.5 mL 1.8 mmol·mL-1水楊酸-乙醇溶液和0.1 mL 0.3% H2O2溶液啟動反應,振蕩混勻后置于37℃水浴30 min。以蒸餾水作空白,在510 nm 波長處測定吸光度值A1,用0.1 mL 蒸餾水代替H2O2,按上述步驟測定吸光值A2,再以蒸餾水代替糖蛋白溶液,測定吸光值A0。對照組為相同濃度的Vc 溶液,按照公式計算羥基自由基清除率：

式中,A0：對照組吸光度值;A1：糖蛋白自由基清除吸光度值;A2：未啟動反應的吸光度值。

1.3.5 CGG 的Fe3+還原能力的測定 參考趙謀明等[17]和鄭春紅等[18]的方法。分別制備不同濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1)的樣品各2 mL,分別依次加入2 mL 0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 值6.6)和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻后置于50℃水浴20 min,然后加入2 mL 10%三氯乙酸溶液,振蕩混勻后于3 000 r·min-1條件下離心5 min,保留上清液。取2 mL 上清液,加入2 mL 蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液,混勻后于50℃條件下保溫10 min,當溶液由黃色變為藍色后,于700 nm 波長處測定吸光度值,以蒸餾水代替樣品作為空白對照。對照組為相同濃度的Vc 溶液。

1.3.6 體內抗氧化活性動物試驗 動物分組及處理：選擇健康的ICR 小鼠40 只,于溫度21 ～25℃、相對濕度45%～55%,空氣流通的環境中適應飼養,期間自由進水和飲食。飼養1 周后將小鼠隨機分為空白對照組(生理鹽水)、低劑量組(100 mg·kg-1BW CGG)、中劑量組( 200 mg·kg-1BW CGG)、高劑量組( 400 mg·kg-1BW CGG)4 組,每組10 只。各試驗組每日定時灌胃,灌胃前記錄體重,試驗共進行30 d。

樣品采集：30 d 喂養結束后末次給藥,休息30 min,然后眼眶取血,用雙蒸水配成溶血液,按照試劑盒說明測定全血中過氧化氫酶(catalae, CAT)活力和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPx)活性,同時,開腹取臟器,低溫生理鹽水漂洗干凈,拭干、稱重,并按照公式計算臟器指數[19-20]：

式中,y：臟器指數;m：小鼠臟器質量,g;M：小鼠體質量,g。

1.3.7 供試菌株活化 參考王鴻飛等[21]的方法。在無菌室中將供試菌接入相應的試管斜面培養基上,然后置于37℃恒溫培養箱內培養18～24 h,最后置于0～4℃冷藏備用。

表1 供試菌種Table 1 Tested species

配制液體瓊脂培養基于121℃殺菌20 min,冷卻后用接種環從斜面培養基上挑取一環菌種置于10 mL滅菌培養基中,然后置于37℃搖床培養24 h,使得菌懸液濃度約為106～107CFU·mL-1。

1.3.8 CGG 抑菌活性的測定 參照徐超等[20]的方法。取9 個平板培養皿,將1.3.7 中的各試驗菌的菌懸液(0.1 mL)分別均勻涂布在平板培養皿上,每皿輕輕放置5 個牛津杯,設置樣品組(3.5、7.0、14.0 mg·mL-1CGG)、陽性對照組(10 μg·mL-1硫酸慶大霉素)、陰性對照組(無菌水),每組設3 個重復。置于37℃暗箱培養24 h,觀察并測定抑菌圈直徑。

1.3.9 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)：采用兩倍稀釋法[21]。取18 支試管,分成3 組,每組6 支試管并進行編號。在已滅菌的試管中分別依次加入1 mL 液體瓊脂培養基、1 mL 不同濃度的糖蛋白液(0.875、1.25、3.5、7、14、28 mg·mL-1)和0.1 mL 試驗菌,然后置于37℃恒溫培養箱中恒溫培養24 h,觀察并細菌記錄生長情況,溶液澄清,無肉眼可見細菌生長的最低濃度為MIC。

最低殺菌濃度 ( minimum bactericidal concentration,MBC)：參照王鴻飛等[21]的方法。將MIC 試驗中的液體培養物分別倒入平板培養皿,于37℃下培養24 h,觀察菌落的生長情況,以培養皿中無細菌生長的最低糖蛋白濃度為MBC。

1.4 數據分析

每試驗設3 個平行樣,結果以平均值±標準偏差(mean±SD) 表示。采用Origin 8.5 對試驗數據進行處理分析,并用SAS 17.0 ANOVA 對試驗數據進行方差分析,P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 CGG 的體外抗氧化能力

由圖1 可知,CGG 的體外抗氧化能力總體顯著低于Vc(P＜0.05),但隨著CGG 濃度的增加,其總體抗氧化能力逐漸增強,其中,超氧陰離子自由基清除率從17.51%增大至56.24%,羥基自由基清除率從10.38%增長至57.94%,兩者增幅顯著,說明CGG 有一定的抗氧化能力。此外,試驗過程中發現CGG 的醇溶性較差,這可能導致CGG 的DPPH 自由基清除作用遠低于Vc。隨著CGG 濃度的增加,CGG 和Vc 的Fe3+還原能力的吸光度值均有所提高,但Vc 的吸光度值增幅顯著高于CGG,說明CGG 具有還原能力,但其還原能力較弱。

2.2 CGG 對小鼠體重及肝臟指數的影響

由表2 可知,灌胃前各試驗組小鼠體重無顯著性差異,說明本試驗具有統計學意義,連續灌胃30 d 后,各試驗組小鼠體重增量隨著CGG 濃度的增加而增大,中劑量組和高劑量組小鼠增重顯著大于空白對照組(P＜0.05),但其肝臟指數與空白對照組無顯著差異,表明CGG 對小鼠基本無毒副作用,不會影響小鼠的正常生長發育[22-23]。

2.3 CGG 對小鼠體內抗氧化作用的影響

由圖2 可知,隨著CGG 濃度的增加,CAT 活性和GSH-PX 活性均呈現增加趨勢,與空白對照組相比,低、中、高劑量組CAT 活性分別提高了21.91%、126.29%、135.63%,GSH-PX 活性分別提高了2.04%、24.69%、28.13%,其中,中、高劑量組差異均顯著(P＜0.05)。綜上說明,CGG 能顯著提高小鼠體內抗氧化酶活性,且中、高劑量組效果尤為明顯。

圖1 CGG 的體外抗氧化作用Fig.1 In vitro antioxidant activity of cuttlefish glandular gland glycoprotein

表2 CGG 對小鼠體重及肝臟指數的影響Table 2 Effects of cuttlefish glandular gland glycoprotein on the body weight and liver index of mice

2.4 CGG 的抑菌活性研究

圖2 CGG 的體內抗氧化作用Fig.2 In vivo antioxidation of cuttlefish glandular gland glycoprotein

由表3 可知,與陰性對照組相比,CGG 樣品組對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌均有一定的抑制效果,且隨著CGG 濃度的增加,其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌的抑制效果逐漸增強,其中對大腸桿菌的抑制效果較為明顯。結合圖3 可知,CGG 有一定的抑菌效果,但抑菌作用弱于陽性對照組,各試驗組抑菌效果的強弱依次為：陽性對照組＞14.0 mg·mL-1CGG 樣品組＞7.0 mg·mL-1CGG 樣品組＞3.5 mg·mL-1CGG 樣品組＞陰性對照組。

2.5 最低抑菌濃度與最低殺菌濃度的確定

由表4、表5 可知,CGG 對大腸桿菌、金黃色葡萄菌和假單胞菌的 MIC 分別為1.25、7.00、7.00 mg·mL-1;CGG 對大腸桿菌、金黃色葡萄菌和假單胞菌的MIC 分別為14、28、14 mg·mL-1。綜上表明,CGG 對以上3 種菌均有抑制效果,但需要較高的濃度才能達到較明顯的抑制效果。

表3 CGG 的抑菌圈直徑Table 3 Antimicrobial effect of CGG/mm

表4 CGG 的最低抑菌濃度Table 4 The MIC of CGG

表5 CGG 的最低殺菌濃度Table 5 The MBC of CGG

3 討論

圖3 CGG 抑菌效果Fig.3 Antimicrobial effect of CGG

本試驗結果表明,隨著CGG 濃度的增加,其體外總抗氧化能力逐漸增強,其中,超氧陰離子自由基清除率從17.51%增大至55.84%,DPPH 自由基清除率從5.7%增加至19.5%,羥基自由基清除率從10.38%增長至57.94%,Fe3+還原能力的吸光度值從0.095 增大至0.65,說明墨魚纏卵腺中提取的糖蛋白具有較強的體外抗氧化作用,這王倩[24]的結論類似,而李雨哲等[25]在馬氏珍珠貝肉糖蛋白的抗氧化活性研究中得出,珍珠貝肉糖蛋白的DPPH 自由基清除率為68.92%,超氧陰離子自由基清除率為44.61%,與本試驗結果有一定的差異,這可能是因為CGG 與珍珠貝肉中糖蛋白的蛋白與糖的種類及結合位點有較大差異。夏秀芳等[26]將大豆中蛋白提取后與葡萄糖混合制備糖蛋白,并對其進行抗氧化試驗,得出大豆糖蛋白的羥基自由基清除率最高僅為5.87%,與本研究結論差異較大,可能是由于人工合成的糖蛋白中糖和蛋白之間未完全結合,且植物糖蛋白與動物糖蛋白也存在一定差異。

CAT 是一種觸酶,是過氧化物酶體的標志酶,是機體生物防御體系的關鍵酶之一;GSH-PX 是機體廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶,具有保護細胞膜結構和功能完整的作用[27]。本研究通過小鼠試驗發現,灌胃30 d 后,與空白組相比,中劑量組和高劑量組體重均差異顯著(P＜0.05),但各試驗組小鼠肝臟指數無統計學差異,說明糖蛋白度小鼠無毒副作用,能夠保證小鼠正常生長;與空白對照組相比,中、高劑量組均能顯著提高CAT 和GSH-PX 活性,說明CGG能有效提高小鼠體內抗氧化活性,這與王倩[24]、牛付閣等[28]的研究結果類似,說明墨魚纏腺具有良好的體內抗氧化作用。

本研究中,CGG 能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌的生長,當CGG 濃度為14 mg·mL-1時,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌的抑菌圈直徑分別為13.7±0.14、14.6±0.19、15.5±0.27 mm。此外,CGG 對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌的MIC 分別為1.25、7.00、7.00 mg·mL-1,MBC 分別為14、28、14 mg·mL-1,說明CGG 具有一定的抑菌活性。付丹[29]從雞蛋清中提取出一種卵粘蛋白,并研究了其抑菌特性,發現卵粘蛋白對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌效果,MIC 為62.5 μg·mL-1,但對大腸桿菌沒有明顯抑菌效果,這可能是因為CGG 與雞蛋清中的卵粘蛋白組成結構不一致;師曉棟[30]在玫瑰無須鰓中提取純化了卵黃蛋白原及卵黃脂磷蛋白并研究其抑菌性,發現它們對大腸桿菌、產氣桿菌和金黃色葡萄球菌能產生明顯的抑菌效果,卵黃蛋白原和卵黃脂磷蛋白的MIC 分別為40、80 μg·mL-1,與本研究結果類似。

4 結論

本試驗在前人研究基礎上,對墨魚纏卵腺糖蛋白(CGG)的抗氧化及抑菌活性進行了研究,結果顯示,隨著CGG 濃度的增加,其各項體外抗氧化能力指標均增強,且能有效提高小鼠體內抗氧化能力;抑菌試驗結果表明,CGG 能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌的生長,其中對大腸桿菌的抑制效果最明顯,說明CGG 具有一定抗氧化和抑菌作用,這為后續CGG保健產品的研究提供了一定的理論基礎,也為提高墨魚纏卵腺資源利用率提供了理論支持。本研究對CGG 的抗疲勞、降血脂活性方面及墨魚纏卵腺糖蛋功能性產品應用方面尚未涉及,這將是下一步研究的重點。