雞新城疫病毒RT-PCR檢測方法的建立及應用

李鳳琴 葉 超

(西昌學院動物科學學院,四川西昌 625013)

新城疫病毒屬副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬，禽副黏病毒Ⅰ型，宿主范圍廣泛，給養禽業和公共衛生安全帶來了較大的隱患。

新城疫病毒經常使用的鑒定方法有雞胚接種、HA和HI試驗、瓊脂擴散、免疫熒光技術（IFA）、免疫組化技術等，但比較起來，RT-PCR通過體外擴增RNA的片段方法，具有特異性強、敏感性高的優點，易于操作等優勢。

1 方法

試驗于攀西動物疫病檢測與防控省級重點實驗完成。

以序列GQ338311.1的F蛋白基因序列為模板，使用專業的引物設計軟件設計引物，上游引物為ATCGGCACAGATAACAGC，下游引物為TCACCACCTTCGGGAC，預計擴增片段為578bp。

用天根生化科技北京有限公司的試劑盒提取總RNA，以弱毒陽性株總RNA為陽性對照，無RNA酶水為陰性對照，反轉錄后用25微升體系進行擴增，優化反應程序，并對其特異性和靈敏度進行檢測。

用建立的RT-PCR方法對采集的100份雞呼吸道分泌物或排泄物樣品進行檢測。

2 結果

建立的RT-PCR方法的最優條件為25微升體系，95℃ 5min；95℃ 30S，54.2℃ 45S，72℃ 50S，運行35個循環；72 ℃10min，能在500～750bp之間出現明亮的單一條帶（如圖1）；經測序和多病毒RNA混合物RT-PCR發現該方法特異性強；靈敏為0.005682μg/ml。

圖1 F基因RT-PCR擴增結果

用建立的方法對采集100份樣品進行檢測，其中2份為陽性，陽性率為2%。

3 討論

在本次試驗對100份樣進行檢測，發現有兩份陽性樣品，可能是接種的活疫苗，也有可能是說雞新城疫病毒感染，若要確診，需結合樣品來源雞場的發病情況等。雞新城疫病毒傳播迅速，雞發病后死亡率很高，是嚴重危害我國養禽業的重要疾病之一，該地區需要做好雞新城疫的檢測和防控工作。