微生物發酵法制備富含γ-氨基丁酸的桑葉復合粉

陳佩珊　陳芳艷

微生物發酵法制備富含γ-氨基丁酸的桑葉復合粉

陳佩珊陳芳艷

（華南農業大學動物科學學院廣東廣州510642）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）具有神經傳遞、降血壓、利尿和鎮定等生理功能。為了開發富含GABA的桑葉產品，文章在實驗室中從桑葉分離篩選到的植物乳植菌SG-5作為發酵菌種，應用于桑葉GABA的發酵富集，以桑葉為主要原料，開展四因素三水平的正交實驗，得到最優配方和最優發件條件：最佳配方組合為葡萄糖2 %、蛋白胨8 %、K2HPO42.0 %和L-谷氨酸鈉 1.5 %，各配方成分影響主次順序從大到小依次為葡萄糖＞蛋白胨＞K2HPO4＞L-谷氨酸鈉；最優發酵條件為溫度為30 ℃，發酵時間36 h，接種量5%，初始含水量60%，各發酵條件影響主次順序從大到小依次為培養溫度、接種量、初始含水量、培養時間。在此最優條件下獲得發酵桑葉粉的 GABA含量為31.46 mg/g，蛋白質含量為1.93 mg/g，總糖含量為34.13 mg/g，pH值為5.69。

桑葉粉；γ-氨基丁酸；植物乳桿菌；固態發酵培養

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA)是哺乳動物神經中樞的一種抑制性遞質，具有調節血壓、促使精神安定、促進腦部血流等作用[1～4]。1959年，Elliott和Hobbiger通過實驗證明靜脈注射GABA可以使血壓下降[5]。而DianaM. 等人的研究結果表明通過飲食富含GABA的功能食品亦可降低和預防高血壓[6]。天然的GABA存在于蔬菜和水果等植物當中，但是其含量很低，直接在食品中添加人工合成的GABA，不屬于天然產物，應用有條件限制[7～9]。通過微生物發酵的方法來提高食品中GABA的含量是一種有效的途徑。可以發酵生產GABA的微生物有細菌、真菌和酵母[10～12 ]。這些菌能產生谷氨酸脫羧酶（GAD），并催化谷氨酸合成GABA。其中乳酸細菌是人和動物胃腸道中正常菌群，不僅具有抗菌、降低膽固醇、抑癌和增強免疫力等重要生物學功能，還可賦予食品特殊的風味，是具有安全性的食品微生物[13]。

桑葉是桑科植物的葉子，桑樹在我國種植廣泛，生命力極強，資源豐富。桑葉主要作為養蠶，它也是傳統的中草藥。桑葉作為藥食兩用資源的記載如《神農本草》《本草綱目》《中華人民共和國藥典》均有詳細的資料。20 世紀以來，我國及國際上對桑樹等藥物的有效成分進行大量的研究，明確其活性成分化學結構和藥用功能等如黃酮類、多糖類、甾醇類、生物堿等，對這些活性物質治療糖尿病、高血脂、高血壓的療效進行了深入的研究[14～18 ]。隨著醫學及相關科學的發展，桑樹資源的醫用價值也得到進一步拓展。本課題組研究桑葉的過程中發現桑嫩葉的GABA含量較高。在此基礎上分離純化出GABA并且用于灌胃高血壓模型鼠，結果表明對高血壓大鼠起到降低血壓的作用。

為了提高桑嫩葉中GABA含量，達到開發降血壓功能保健食品的目的，本研究將從桑葉中篩選分離出高產GABA桿物乳酸菌SG-5應用于桑葉粉的固態發酵的研究，以期低成本獲得富含GABA桑葉粉，為今后開發預防和控制高血壓的桑葉藥食產品提供原料，拓展桑葉在醫藥衛生、保健食品等領域的新用途。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

材料：桑葉千目粉；試驗菌株：SG-5菌株，從桑葉中分離純化得到；試劑：GABA標準品購于Sigma公司，色譜純；MRS培養基；LaCl3，Na2CO3，NaHCO3，KOH等均為市售分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化及擴大培養

取出冷凍的菌種，解凍后，挑取菌于MRS固體培養基上進行劃線，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。24 h后MRS固體培養基上長出許多白色菌落，重復2次劃線，出現單個菌落。挑取單菌落接入裝有10 mLMRS液體培養基的離心管中，于37 ℃恒溫培養箱中震蕩培養8 h。8 h后離心管底部出現白色混濁，搖勻，按2 %接種量接入50 mLMRS培養基中于37 ℃恒溫培養箱中培養8 h至混濁。7～8 h時菌體處于最活躍的狀態，故選擇接種種齡為7～8 h的SG-5菌加入桑葉粉中進行固態發酵實驗。

1.2.2 固態發酵培養基配方

配制固態發酵培養基，以桑葉粉為基質，選擇葡萄糖作為碳源，蛋白胨作為氮源，添加K2HPO4和L-谷氨酸鈉作為生長因子。以發酵產物中GABA的含量為指標，研究葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸鈉4個主要因素對固體發酵的影響，進行四因素三水平L9(34)正交試驗確定最佳培養基配方。按正交試驗設計表1安排實驗。以10 g培養基為例，2 %葡萄糖即稱量0.2 g葡萄糖加入到培養基中。

表1　正交試驗設計

1.2.3 固態發酵條件的確定

發酵條件主要研究初始含水量、菌體接種量、發酵時間和發酵溫度對固體發酵的影響，以產GABA的含量為指標，進行四因素三水平L9(34)正交試驗確定固體發酵培養的最佳條件。按正交試驗設計表2安排實驗。

表2　正交試驗設計

1.2.4 Berthelot比色法測定GABA的含量

參照陳恒文等的檢測方法，以不同濃度的GABA標準樣品繪制標準曲線[19]。得到回歸方程為y=0.2283 x+0.0072 ，R2=0.9952 。

稱取1 g樣品，放入50 mL三角瓶中，加入20 mL無菌蒸餾水和適量玻璃珠，在37 ℃恒溫培養箱中震蕩2 h,轉速約為170～220 r/min。將震蕩后的渾濁液以8 000 r/min的轉速離心10 min，取上清液，測定樣品中GABA的含量。

1.2.5 蛋白質含量測定

蛋白質含量的測定按Bradford的方法[20]。以不同濃度的牛血清白蛋白標準樣品繪制標準曲線，得到標準曲線公式y=0.8243 x-0.001 ，R2=0.9932 。

稱取1 g經過干燥后的樣品，加入蒸餾水9 mL，以170 ～190 r/min震蕩30 min，過濾取濾液測定蛋白質的含量。

1.2.6 總糖含量的測定

采用蒽酮比色法測定總糖含量[21]。以不同濃度的葡萄糖標準品繪制標準曲線，到標準曲線公式y=0.3178 x+0.0046 ，R2=0.9947 。

稱取1 g干燥后樣品，加入1.25 % HCL 100 mL，沸水浴2h，過濾取濾液用蒸餾水定容至100 mL備用，加I2-KI以防變色，取濾液測定總糖的含量。

1.2.7 pH值測定

取樣品1 g，加蒸餾水9 mL，于搖床上175 r/min震蕩30 min，過濾取濾液，用pH儀測定濾液pH值。

2 結果與分析

2.1 確定培養基配方

研究葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸鈉4個主要因素對固體發酵的影響，每個因素設3個水平，進行四因素三水平L9(34)正交試驗，共9組試驗號。以發酵產物產GABA的量為指標，實驗結果見表3，對結果進行方差分析見表4～表6，確定最佳培養基配方。

表3　培養基配方優化正交實驗結果

表4　不同配方添加量對GABA產量影響的方差分析

表5　用鄧肯氏新復極差法測定葡萄糖添加量顯著性梯形表

表6　各成分添加量對GABA產量影響分析

正交試驗結果(表4)表明，影響桑葉粉固態發酵配方的主次順序從大到小依次為葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸鈉。葡萄糖添加量對GABA產量的影響最為顯著，其影響為(見表5)：三個水平中葡萄糖增加量與GABA產量成反比。當葡萄糖添加量為2 %時，GABA產量最高，且明顯大于添加量為6 %和10 %，葡萄糖添加量2 %時GABA產量的平均值是添加量10 %時的三倍。其次，表6可見蛋白胨添加量對GABA產量的影響也較大，與葡萄糖添加量相反，隨著蛋白胨的增加，GABA產量也越來越高。K2HPO4添加量的影響次于蛋白胨添加量，最佳添加量為2.0 %。L-谷氨酸鈉添加量的影響最小，添加量在0.5 %和1.0 %時GABA產量并無多大差別。

分析結果得出培養條件的最佳組合為葡萄糖添加量2 %、蛋白胨添加量8 %、K2HPO42.0 %和 L-谷氨酸鈉 1.5 %。

2.2 確定發酵條件

研究葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸鈉4個主要因素對固體發酵的影響，每個因素設3個水平，進行四因素三水平L9(34)正交試驗，共9組試驗號。以發酵產物產GABA的量為指標，得到實驗結果（表7）并進行方差分析，確定固體發酵培養的最佳條件。

表7　發酵條件優化正交試驗結果

表8　不同發酵條件對GABA產量影響的方差分析

表9　不同發酵條件對GABA產量影響的分析

正交試驗(表8)結果表明，四個因素中，對影響桑葉粉固態發酵條件最大的是發酵溫度、接種量、初始含水量、發酵時間。表9可見，當發酵溫度設定為30 ℃時，GABA產量明顯比發酵溫度設定為35 ℃和40 ℃時高，30 ℃的GABA平均產量幾乎是35 ℃時的兩倍。其次，接種量對GABA產量的影響也較大，接種量與GABA平均產量不成線性關系。接種量為5 %時，GABA產量最高。初始含水量的影響次于接種量，最佳添加量為60.0 %。發酵時間的影響GABA產量最不顯著，GABA產量平均值差別不大。

分析結果得出固態培養基配方的最佳組合：發酵溫度為30 ℃，發酵時間為36 h，接種量5 %，初始含水量60 %。

2.3 發酵產物主要成分及pH值測定

發酵后的桑葉粉細粉末呈棕綠色，較松軟，散發出發酵酸菜的氣味，而發酵液氣味較清香。對富含 γ-氨基丁酸桑葉粉發酵產物中的主要成分進行測定，測出在最佳配方及最佳培養條件下產GABA的量為31.46 mg/g，而未發酵桑葉粉產 GABA的量為2.77 mg/g，最佳條件下GABA的產量比未發酵前提高了近11 倍。發酵產品蛋白質含量為1.93 mg/g，總糖含量為34.13 mg/g，發酵產品的pH為5.69 。

3 討論與結論

自從出現微生物發酵法生產GABA，最常用的菌種有乳酸菌和大腸桿菌，通常利用乳酸菌生產較安全，大腸桿菌通常與基因工程相結合進行改造，生產GABA有一定的風險；其次為酵母菌、曲霉菌等[22]。據研究，以酵母菌為菌株，在對其發酵特性的研究基礎上，菌株的 GABA質量濃度為指標開展研究，培養基配方優化后，菌株的 GABA質量濃度提高了近 4 倍，達到 3.63 g/L[23]。李科等發現植物乳桿菌 UL-4顯示出良好的耐酸耐膽鹽特性；在腸道具備一定的粘附和定植能力；菌株有良好的抑菌特性，尤其是金黃色葡萄球菌，抑菌圈達到15.77 mm；UL-4還具備對膽固醇和甘油三酯的降解能力，降解率分別為 73.23%和 19.11%[24]。可用來開發功能性的食品。本實驗以實驗室分離到的SG-5植物乳桿菌株發酵桑葉粉，探討發酵條件對GABA產量的影響。

滿足菌體生長的培養基需具備碳源，氮源以及生長因子，選擇了葡萄糖和蛋白胨作為碳源，氮源，以便SG-5菌株產生更多GABA。足夠量的K2HPO4無機鹽可保證菌體正常的生長代謝，L-谷氨酸鈉是發酵過程中GABA生成的底物，也可為菌體生長提供氮源。添加少量L-谷氨酸鈉，發酵液中GABA也隨之增長。這幾種物質的含量并不是越多越好，當添加的量超過菌體所需，就會起反效果，抑制菌體生長影響產量。固態發酵時，GABA含量隨著菌體的生長進行合成。菌體生長對初始含水量需求較高，含水量低不適合菌體的生長。當菌體進入生長平衡期，發酵產物GABA會被菌體自身利用而導致含量降低。發酵溫度及接種量控制不好則影響菌體的生長，從而影響GABA的產量。

最佳發酵配方為：以桑葉粉為基質，葡萄糖添加量2 %、蛋白胨添加量8 %、K2HPO42.0 % 和L-谷氨酸鈉1.5 %。最優培養溫度為30 ℃，培養時間為36 h，接種量5 %，初始含水量60 % 時。在最佳配方和最佳發酵條件下桑葉 GABA的產量為31.46 mg/g，而未發酵桑葉粉 GABA含量為2.77 mg/g，最佳條件下GABA的產量比未發酵前提高了近11倍。發酵產品蛋白質含量為1.93 mg/g，總糖含量為34.13 mg/g，發酵產品的pH為5.69。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2019.05.01

廣東省科技計劃項目（2017A020208044）；國家農業部公益性行業（農業）科研專項（201403064）。

陳佩珊（1994－），女，廣西玉林人，2015級蠶學本科生。

陳芳艷，博士，副教授，碩士導師。

S888.2

B

2095-1205(2019)05-01-05