人類線粒體肌酸激酶的固定化及酶學性質研究

呂廣新，史北辰，樊帥，楊兆勇，張志斐，陳靜

人類線粒體肌酸激酶的固定化及酶學性質研究

呂廣新*，史北辰*，樊帥，楊兆勇，張志斐，陳靜

063210 唐山，華北理工大學基礎醫學院（呂廣新、陳靜），藥學院（史北辰、張志斐）；100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所微生物代謝工程室（樊帥、楊兆勇）

人源肌酸激酶 uMtCK 具有良好的催化肌酸生成磷酸肌酸的活性，開發固定化uMtCK 酶法生成磷酸肌酸，實現其工業化應用價值。

將異源表達的 uMtCK 固定在納米磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 上，制備固定化酶Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK，并進行催化反應。與游離酶 uMtCK 比對酶學性質和動力學參數，測定固定化酶 Fe3O4@Histidine-Ni/ uMtCK 的重復使用次數。

與游離酶 uMtCK 相比，固定化酶 Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK 的最適反應溫度提高5 ℃，最適 pH 降低 0.5 個單位，在50 ℃、pH 7.5 下孵育 2 h，殘余酶活為 51%，而游離酶僅為 27%；uMtCK 的K為 10.7 mmol/L，為 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的 1.1 倍；Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK 的k/K值是 5.3 L/(mmol·s)，是 uMtCK 的 1.3 倍；Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在經歷 9 次循環使用后，活力還能保持 50 % 以上，顯示了良好的穩定性和重復使用性。

與 uMtCK 相比，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 具有良好的熱穩定性和重復使用性，具有一定的工業化價值。

酶類，固相； 肌酸激酶； 磷酸肌酸

磷酸肌酸（creatine phosphate，CrP）是脊椎動物細胞能量代謝中發揮重要作用的高能磷酸化合物[1]，在如心臟、大腦和骨骼肌等高能量需求的器官中，CrP 對于能量的平衡起著至關重要的作用[1]。肌原纖維的收縮[2]、葡萄糖的攝取[3]以及蛋白質的合成[4]均依賴 CrP 的供能。磷酸肌酸在臨床上應用廣泛，現已證實外源性磷酸肌酸可維持術后體內高能磷酸水平和心肌細胞的正常能量代謝，保護磷脂膜而使細胞膜的結構穩定，保護心肌，使心臟正常收縮，降低心臟不良事件的發生。心血管治療及其輔助治療藥物具有巨大的市場潛力，注射用磷酸肌酸鈉作為心肌保護藥物年銷售額過十億。

現階段磷酸肌酸鈉的合成主要有化學合成法和酶法合成?；瘜W合成方法產率較低，純化工藝復雜、條件苛刻，易有重金屬殘留，且工業三廢和有毒有害物質用量較大，不利于環保。

酶的蛋白質屬性決定了其催化條件溫和、反應高效和底物的高度選擇性等特點，而且酶作為一類生物催化劑，可以實現許多化學合成難以實現的反應，并且對環境友好。但是游離酶催化后不能收回，無法實現連續催化反應，因此酶的固定化在工業上應用越來越廣泛。常見的酶固定化材料包括天然聚合物[5]、合成聚合物[6]、多孔介質[7]以及磁性介質[8]，其中磁性納米材料具有比表面積大、回收迅速和工藝簡單等優點。

在脊椎動物體內，肌酸激酶（creatine kinase，CK，EC 2.7.3.2）催化肌酸和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）可逆生成 CrP 和腺嘌呤核苷二磷酸（ADP）（圖 1），通過此步反應可以維持脊椎動物體內能量循環的穩定[9-10]。前期研究已采用雜化密度泛函理論方法對人類線粒體肌酸激酶（uMtCK）的催化機制進行了詳細的闡述[11]，并對底物結合位點進行了詳細的分析[12]，基于 uMtCK 所顯示出的催化活性和穩定性，具有一定的工業化生產 CrP 的潛能，本文擬通過納米級磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni[13]固定化的方法探討 uMtCK 的工業化應用。

本文通過將 uMtCK 固定在納米級磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 上[14]，進而催化 Cr 和 ATP 生成 CrP 和 ADP 反應的研究，比較游離酶和固定化酶酶學和動力學性質，測定重復使用批次，探討磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 固定化 uMtCK 工業化應用的可能性。

圖 1 肌酸激酶的催化反應

Figure 1 The catalytic reaction of creatine kinase

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 uMtCK 表達菌株BL21(DE3) 購自美國Novagen 公司；表達質粒pET-28CK 為前期本實驗室構建[11]；Cr 和 ATP 均購自美國 Sigma 公司；蛋白胨和酵母膏購自美國Thermo Fisher 公司；30 K 超濾濃縮管購自美國Millipore 公司；肌酸激酶活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基 LB 培養基：蛋白胨 10 g/L、酵母膏 5 g/L、NaCl 10 g/L，121 ℃滅菌 15 min。

1.2 方法

1.2.1 重組 uMtCK 的表達與純化[11]將實驗室前期構建的表達 uMtCK 工程菌株經平板活化，轉接在 LB 培養基（包含 Kan 50 μg/ml），37 ℃、200 r/min 培養過夜后轉接相同的條件培養到600值為 0.6 ~ 0.8，然后加入 0.2 mmol/L IPTG，18 ℃、200 r/min 誘導表達 16 h。收集誘導培養的菌體 4000 r/min，4 ℃離心 10 min，倒掉上清后用 Lysis buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑，pH 7.4）重懸，利用高壓均質機破碎 2 遍，18 000 r/min、4 ℃離心 30 min，收集上清備用。由于 pET-28a(+) 帶有 His6標簽，因此可選用 TALON? Metal Affinity Resin 來進行目的蛋白的純化。首先將收集的上清用0.45 μm 濾膜過濾，然后與經 Lysis buffer 平衡后的基質在4 ℃下結合 1 h，然后用 Washing buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑，pH 7.4）5 倍柱體積沖洗，最后用 Elution buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑，pH 7.4）洗脫目的蛋白，經 SDS-PAGE 檢測后將目的蛋白用 30 K 超濾濃縮管進行脫鹽濃縮后備用。

1.2.2 重組 uMtCK 的固定化 取一定量純化后的 uMtCK 與磁性材料Fe3O4@Histidine-Ni 在20 mmol/L Tris和 150 mmol/L NaCl，pH 8.0 下結合 2 h，利用磁鐵吸附填料，并測定上清未固定蛋白的量，與目的蛋白初始量相減從而確定固定蛋白的量。

1.2.3 uMtCK 及其突變體的活性測定 使用肌酸激酶活性測定試劑盒，根據肌酸激酶反應原理，通過在 35 ℃、pH 7.5 條件下，測定 λ660 nm磷鉬酸鹽顯色來表征活性。

1.2.4 游離酶 uMtCK 和固定化酶 Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 酶學性質分析

1.2.4.1 最適反應溫度的測定 將 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在不同溫度（20、30、35、40、45、50和 60 ℃），pH 7.5 的條件下測定酶活性，將最高活力定為 100%。

1.2.4.2 溫度穩定性的測定 測定uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK在 50 ℃、pH 7.5 不同保溫時間的殘余酶活，將 uMtCK 和 Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 在50 ℃、pH 7.5 下孵育 2.5 h，每半小時取樣后在冰上孵育 5 min 后測定活性，0 h的活性為 100%。

1.2.4.3 最適反應 pH 的測定 40 ℃下測定uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0 和 9.0）的活性，將測得的最高活力定為100%。

1.2.4.4 pH 穩定性的測定 將 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在pH 5.0、40 ℃下孵育 2.5 h，每半小時取樣在冰上孵育 5 min 后測定活性，以pH 5.0、40 ℃下孵育 0 h 的活性為 100%。

1.2.5 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 酶動力學分析

1.2.5.1 K值的測定 以不同濃度（1、2、5、7、10、15、20 和 30 mmol/L）肌酸、20 mmol/L Tris（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L ATP 為底物，分別加入一定量的 uMtCK 或 Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK，35 ℃反應 5 min，測定uMtCK 在不同底物濃度的反應體系中的活性，通過軟件 GraphPad Prism v5.0 中 Michaelis-Menten 方程計算酶反應的V和K。

1.2.5.2K值的測定 不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、1、1.6、4 和 8 mmol/L）ATP、25 mmol/L Cr、5 mmol/L Mg2+為底物，在20 mmol/L Tris（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl 下分別加入適量 uMtCK 或 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK，35 ℃反應 5 min，測定 uMtCK 在不同 ATP 濃度的反應體系中的活性，通過軟件 GraphPad Prism v5.0 中 Michaelis- Menten 方程以計算酶反應的V和K。

1.2.5.3 催化常數k值的測定 已知酶濃度，根據測得的V值以及公式V=k[E] 計算k值，其中[E] 代表酶的濃度。

1.2.6 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復使用次數分析 通過測定 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復使用 15 次的酶活性，確定固定化 uMtCK 的重復使用批次，活性測定方法同 1.2.3，每次吸附磁性材料除去上清后，用 1 倍柱體積的緩沖液（20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 7.5）清洗磁性材料，第一次測定的活性記為 100%。

2 結果

2.1 uMtCK 的表達與純化

利用實驗室前期構建的表達菌株 BL21(DE3)/ pET-28CK 在 0.2 mmol/L IPTG、20 ℃、12 h 條件下誘導 uMtCK 的表達，利用 Co2+親和樹脂和分子排阻色譜 Superdex 75 10/300 GL 純化后，經 SDS-PAGE 檢測，結果見圖 2。利用 30 kD 超濾管更換蛋白緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT、10% 甘油，pH 8.0）備用。

M：蛋白分子量標記；1：uMtCK

Figure 2 SDS-PAGE analysis of uMtCK

2.2 掃描電子顯微鏡分析

為研究固定化酶對 Fe3O4@Histidine-Ni 材料的粒徑大小和形貌的影響，本研究利用掃描電子顯微鏡分析了未固定化 Fe3O4@Histidine-Ni（圖 3A）材料和固定化后的Fe3O4@Histidine-Ni 材料（圖 3B）。結果顯示，未固定化 Fe3O4@Histidine-Ni 材料和固定化后的 Fe3O4@Histidine-Ni 材料的粒徑均在 20 ~ 30 nm，且均成圓粒狀，固定化酶對 Fe3O4@Histidine-Ni 材料無明顯的性狀影響。

2.3 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的酶學性質

2.3.1 溫度對酶活性的影響 在不同溫度（20、30、35、40、45、50、60 ℃）、pH 7.5 下測定 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的活力，結果如圖 4A 所示，uMtCK 的最適溫度為 35 ℃，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的最適作用溫度為40 ℃，比 uMtCK 的最適反應溫度高 5 ℃。

圖 3 掃描電子顯微鏡分析Fe3O4@Histidine-Ni（A）及Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK（B）

Figure 3 SEM images of Fe3O4@Histidine-Ni (A) and Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK (B)

圖 4 溫度對uMtCK 和Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的影響

Figure 4 Effects of temperature on uMtCK and Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK

圖 5 pH 對uMtCK 和Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的影響

Figure 5 Effects of pH on uMtCK and Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK

在50 ℃，pH 7.5 條件下測定 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的穩定性，由圖4B 結果顯示，固定化酶 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 孵育 2 h 以后殘余 51% 的活性，而 uMtCK 僅殘余 27% 的活性。

2.3.2 pH 對酶活性的影響 在不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0 和 9.0）、40 ℃下測定uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的活力，結果如圖 5A 所示，uMtCK 的最適 pH 為 7.5，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的最適 pH 為 7.0，比 uMtCK 降低了 0.5個單位。

在pH 5.0、40 ℃測定 uMtCK 和 Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 的殘余活性，結果如圖 5B 所示，uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的殘余活性變化基本一致。

2.4 uMtCK 游離酶和固定化酶動力學性質

利用不同濃度肌酸為底物，在 35 ℃、pH 7.5 中測得在 λ660 nm下吸光度的變化。通過軟件 GraphPad Prism v5.0 中 Michaelis-Menten 方程計算酶反應的V和K，并計算k值。結果如表 1 所示，在 35 ℃、pH 7.5 的情況下，游離酶 uMtCK 的K為 10.7 mmol/L，為Fe3O4@ Histidine-Ni/uMtCK 的 1.1 倍；Fe3O4@Histidine- Ni/uMtCK 的k/K值是 5.3 L/(mmol·s)，是 uMtCK 的 1.3 倍。

表 1 uMtCK 和 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK催化動力學常數

2.5 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復使用次數分析

可重復使用次數是評價固定化酶的一個重要指標，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復使用次數分析結果如圖 6 所示，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 在經歷 9 次循環使用后，活力還能保持 50% 以上，顯示了良好的穩定性和重復使用性。

圖 6 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 重復使用次數分析

Figure 6 Reusability of Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK

3 討論

眾所周知，游離酶在工業化應用中需要面對產物純化過程中的二次處理，工藝復雜且酶不可重復利用[14]；而固定化酶具有可重復利用和穩定性好等優點從而在工業中廣泛應用。已有部分研究發現固定化會提高酶的耐熱性[15-17]，本研究中，相較于游離酶 uMtCK，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 的最適溫度提高 5 ℃，且在 50 ℃、pH 7.5 條件下，Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 孵育 2 h 以后殘余 51% 的活性，耐熱性的提高有助于固定化酶適應各種工藝要求，拓寬其使用范圍，且溫度的提高有助于增加反應速率[18]，從而提高其催化效率，降低生產成本。由于 uMtCK 催化合成 CrP 的反應釋放質子，因此 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK 最適反應 pH 降低 0.5 個單位有助于酶在產物濃度較高的情況下繼續反應。在每次更換反應物帶來的酶損失和機械力等造成酶變形的不利條件下，固定化酶的重復使用次數基本在 5 ~ 15 次[19]。本研究中 Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK在重復使用 9 次的情況下，能保持殘余活性高于 50%，顯示出磁性材料 Fe3O4@Histidine-Ni 固定化 uMtCK 工業化應用的潛力。

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Ubiquitous mitochondrial creatine kinase fromimmobilized on magnetic nanoparticles and its enzymatic properties in creatine phosphate production

LYU Guang-xin, SHI Bei-chen, FAN Shuai, YANG Zhao-yong, ZHANG Zhi-fei, CHEN Jing

School of Basic Medical Science (LYU Guang-xin, CHEN Jing), School of Pharmacy (SHI Bei-chen, ZHANG Zhi-fei), North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China; Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 10050, China (FAN Shuai, YANG Zhao-yong)

Ubiquitous mitochondrial creatine kinase (uMtCK), belonging to the guanidino kinase superfamily, is reported to catalyze the transformation of creatine into creatine phosphate through the reaction of phosphorylation, making it a highly promising enzyme for the industrial production of creatine phosphate. We aim to develop an immobilized uMtCK for the use of industrial production of creatine phosphate.

The uMtCK stabilized on Fe3O4@Histidine-Ni magnetic nanoparticles, the surfaces of which were modified by Ni2+-immobilized cross-linked Fe3O4@Histidine. The enzyme characterization and enzyme kineticsof the immobilized enzyme Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK was investigated and compared with that of free enzyme uMtCK.

Theoptimum temperature of Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK was higher than that of the uMtCK. The ranges of its pH optimum was decreased about 0.5 unit. Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK exhibited stronger tolerance towards a higher thermostability without obvious difference in a lower pH when compared with the uMtCK. TheKvalue of uMtCK was 1.1 folds higher than that of the Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK, and thek/Kvalues of Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK was 1.3 higher than that of the uMtCK. Furthermore, the Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK maintained 50 % of its original activity after 9 cycles of reuse.

The Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK obtained in the study is efficient with potential application in biocatalytic production of creatine phosphate.

Enzymes, immobilized; Creatine kinase; Creatine phosphate

CHEN Jing, Email: chjingchuchu@hotmail.com; ZHANG Zhi-fei, Email: zhifeiz@outlook.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.003

國家自然科學基金面上項目（81872782）；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程（2016-I2M-3-022）

陳靜，Email：chjingchuchu@hotmail.com；張志斐，Email：zhifeiz@outlook.com

2019-04-12

*同為第一作者