基于表達(dá)熒光蛋白的海分枝桿菌感染斑馬魚模型的抗結(jié)核藥物評價方法的研究

楊國威，彭世澤，趙建元，張永欣，岑山

基于表達(dá)熒光蛋白的海分枝桿菌感染斑馬魚模型的抗結(jié)核藥物評價方法的研究

楊國威*，彭世澤*，趙建元，張永欣，岑山

100124 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所（楊國威）； 100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學(xué)室（彭世澤、趙建元、張永欣、岑山）

為了提高基于熒光檢測的海分枝桿菌-斑馬魚感染模型的靈敏度和準(zhǔn)確度，我們構(gòu)建了毒力較弱的可以表達(dá)紅色熒光蛋白的重組菌 Mm927-pR2HYG，建立了斑馬魚感染模型，用于抗結(jié)核藥物的藥效評價和篩選。

重組菌 Mm927-pR2HYG 經(jīng)受精卵卵黃囊注射感染斑馬魚幼魚，通過測定斑馬魚致死率確定其對斑馬魚的感染性，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察其在斑馬魚體內(nèi)的分布。同時應(yīng)用熒光像素計數(shù)法對異煙肼和利福平的治療效果進(jìn)行評價。

成功構(gòu)建了表達(dá)熒光蛋白的重組海分枝桿菌 Mm927-pR2HYG 感染斑馬魚模型。異煙肼和利福平兩種抗結(jié)核藥物在該模型中均具有良好的治療作用；應(yīng)用熒光像素計數(shù)法和 qPCR 計數(shù)法進(jìn)行的藥效評價結(jié)果具有較好的一致性。

重組海分枝桿菌 Mm927-pR2HYG 感染斑馬魚模型結(jié)合熒光像素計數(shù)法是一種快速、高效、直觀的藥物體內(nèi)評價系統(tǒng)，可以用于抗結(jié)核藥物的高通量篩選。

斑馬魚； 抗結(jié)核藥； 藥物評價； 重組海分枝桿菌； 熒光像素計數(shù)法

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的一種慢性傳染病，具有較高的死亡率。全世界每年約有900 萬新增病例，死亡人數(shù)高達(dá)170 萬，其中肺結(jié)核位列世界十大死因之一，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。目前臨床上應(yīng)用的抗結(jié)核一線藥物包括異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EB）、吡嗪酰胺（PZA）、鏈霉素（SM）五種，能夠治療 80% 以上的新感染結(jié)核患者。但是近年來隨著耐藥結(jié)核菌（MDR-TB 和 XDR-TB）的不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致耐藥結(jié)核病的發(fā)病率日益上升[2-3]，再次讓結(jié)核病患者處于無藥可醫(yī)的窘境，因此，發(fā)展新型抗結(jié)核藥物以及更有效的疫苗迫在眉睫。

新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)依賴于理想的動物模型和篩選方法的建立，但是由于結(jié)核分枝桿菌本身的生長特性以及較高的生物安全級別，使得結(jié)核病動物模型成為抗結(jié)核藥物研發(fā)的瓶頸。常見的動物模型比如靈長類動物和嚙齒類動物，由于倫理、成本以及無法完全模擬結(jié)核病在人體內(nèi)的進(jìn)展等原因，都不適用于大規(guī)模的體內(nèi)藥物篩選[4-5]。而斑馬魚因其通體透明，體型小巧易繁殖，與哺乳動物的基因相似度高等優(yōu)點被廣泛用于多種疾病的致病機(jī)制研究[6-7]。同時以斑馬魚為宿主的海分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌的基因相似度高達(dá) 85% 以上[8]，感染后也能形成干酪樣肉芽腫病變，且生長快，傳染性小，可在 BSL-2 實驗室開展研究，使其成為研究結(jié)核分枝桿菌的優(yōu)良模式病原[9-10]。基于上述原因，海分枝桿菌感染斑馬魚模型已被用于結(jié)核病的致病機(jī)制和發(fā)病病程等基礎(chǔ)研究[11-12]，也有望為抗結(jié)核藥物的篩選和評價提供良好的分析平臺。

利用斑馬魚的光學(xué)透明度，將表達(dá)熒光蛋白的重組海分枝桿菌經(jīng)尾靜脈注射感染受精后 1 d 的斑馬魚幼魚，通過檢測熒光蛋白的表達(dá)間接反映海分枝桿菌的增殖狀態(tài)，可以建立基于熒光的快速藥物篩選平臺[13]。現(xiàn)階段研究中常用的重組菌為毒力較強的海分枝桿菌 M 株。然而我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)斑馬魚魚卵對毒力較弱的海分枝桿菌 927 株的耐受性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對毒力較強的海分枝桿菌 M 株。鑒于重組菌的熒光強度與細(xì)菌數(shù)目呈正相關(guān)，斑馬魚體內(nèi)能夠耐受的細(xì)菌數(shù)目越多，熒光檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性就越高，因此我們擬構(gòu)建表達(dá)紅色熒光蛋白的重組海分枝桿菌 927 株（Mm927-pR2HYG）用于斑馬魚幼魚感染模型的建立，并結(jié)合熒光像素計數(shù)法，探索該模型在抗結(jié)核藥物篩選與評價中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒 pR2HYG，具有潮霉素抗性，表達(dá)紅色熒光蛋白，由劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)系 Lalita Ramakrishnan 博士惠贈。

1.1.2 菌株 海分枝桿菌 M 株（ATCC BAA-535）和 927 株（ATCC 927）接種于 7H11 固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng) 5 ~ 7 d。挑取海分枝桿菌單菌落，轉(zhuǎn)入含有 7H9 液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃靜置培養(yǎng) 5 ~ 7 d。以 1:100 體積比將上述海分枝桿菌菌液接種于搖瓶的 7H9 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.1.3 實驗動物 斑馬魚（）AB 系，由本所張靖溥教授惠贈。斑馬魚養(yǎng)殖于 28 ℃的人工海水中（鹽濃度為 28%），采用人工光源對斑馬魚的生活周期進(jìn)行調(diào)控，照明 14 h/黑暗 10 h 交替進(jìn)行。餌料選用孵化 24 h 的豐年蝦，每日中午飼喂 1 次。本次動物實驗依據(jù)研究所《實驗動物管理條例》中的相關(guān)實驗動物倫理規(guī)范進(jìn)行操作。

1.1.4 試劑和儀器 SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）試劑盒為日本takara公司產(chǎn)品；Stratagene Mx3000P 型 PCR儀為美國Agilent 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 顯微注射 將菌液吸入由毛細(xì)玻璃管制成的注射針中（3 ~ 5 μm）。在100 倍放大鏡下，注射入 1 ~ 4 細(xì)胞期斑馬魚受精卵的卵黃囊中，注射的溶液體積約為 10 pl。

1.2.2 重組海分枝桿菌 927 株（Mm927-pR2HYG）的構(gòu)建 制備海分枝桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，將 1 μg 表達(dá)熒光蛋白的重組質(zhì)粒（pR2HYG）加到400 μl 海分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，充分混勻，冰浴 10 min。然后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電穿孔杯中（直徑為 2 mm），在電壓 2.5 kV，電容 50 μF，電阻 720 Ω 的條件下進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化，脈沖時間 12 ~ 16 ms，放電完畢后立即冰浴 10 min。轉(zhuǎn)化后的海分枝桿菌于不含抗生素的 7H9 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2 ~ 3 h，4000 r/min 離心 10 min 后棄上清，加入 500 μl 新鮮的 7H9 液體培養(yǎng)基重懸。取 50 ~ 100 μl 菌液涂布于含有50 μg/ml 潮霉素的 7H11 固體培養(yǎng)基平板表面，于 37 ℃靜置培養(yǎng) 3 ~ 5 d。

1.2.3 qPCR 計數(shù)法 該方法是通過檢測海分枝桿菌 16S ~ 23S ITS 的拷貝數(shù)來對斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目進(jìn)行定量。16S ~ 23S ITS 通常在一套海分枝桿菌的基因組里只有一個拷貝[14]，因此可以用于反映細(xì)菌的數(shù)目。用 Qiagen 試劑盒提取樣品中的基因組 DNA。擴(kuò)增引物為：F 5' caccacgaga aacactccaa 3'；R 5' acatcccgaaaccaac agag 3'。實時熒光定量 PCR 反應(yīng)體系為 Mix 12.5 μl、10 mmol/L 引物各 1 μl、DNA 3 μl，用 ddH2O 補至 20 μl。反應(yīng)條件為 95 ℃ 10 s，65 ℃ 34 s，共 40 個循環(huán)。每個樣品設(shè)置 3 個重復(fù)，計算各個樣品的平均 CT 值。細(xì)菌計數(shù)采用絕對定量的方法并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將經(jīng)涂布平板計數(shù)的海分枝桿菌梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品與斑馬魚幼魚混合，按照上述實時熒光定量 PCR 方法計算每個稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品的 CT 值，用GraphPad Prism 5.01 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的平均 CT 值，計算斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量。

1.2.4 熒光像素計數(shù)法 攜帶表達(dá)熒光蛋白質(zhì)粒的重組海分枝桿菌感染斑馬魚后，在激光共聚焦顯微鏡下使用激發(fā)波長為 561 nm 的紅色熒光通道進(jìn)行成像觀察，使用volocity library 軟件測量每條斑馬魚的熒光值，同時將 8 條未感染斑馬魚的平均熒光值作為本底，用感染組斑馬魚的熒光值減去本底就是感染斑馬魚體內(nèi)細(xì)菌發(fā)出的熒光值，間接反映了細(xì)菌的數(shù)量。

1.2.5 抗結(jié)核藥物處理 海分枝桿菌感染斑馬魚魚卵 24 h 后，向海水中分別加入終濃度為2 mmol/L 的異煙肼和 400 μmol/L 的利福平進(jìn)行藥物處理，每天更換海水并重新加藥。對照組不給藥，每天只更換海水。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)熒光蛋白的海分枝桿菌 927 株斑馬魚幼魚感染模型的建立

由于之前的大部分研究都是使用海分枝桿菌 M 株進(jìn)行斑馬魚魚卵的感染，而關(guān)于使用重組的海分枝桿菌 927 株進(jìn)行感染的研究鮮有報道，因此我們首先檢測了重組菌 927 株對斑馬魚幼魚的致死作用。采用人工注射的方式分別將相同菌量的重組菌 M 株和重組菌 927 株注射到受精后 2 h 的斑馬魚魚卵的卵黃囊中，同時以 PBS 注射組作為對照。連續(xù)觀察 10 d，記錄每天斑馬魚幼魚的死亡數(shù)量，繪制生存曲線。結(jié)果顯示，在相同注射劑量的情況下（= 1），兩株重組菌對斑馬魚幼魚具有相似的致死作用，在感染后第 4 天開始出現(xiàn)幼魚的死亡，至第 8 天后死亡率達(dá)到最高（圖 1），說明表達(dá)熒光蛋白的重組海分枝桿菌 927 株能夠通過卵黃囊注射的方式有效地感染斑馬魚幼魚，可以用于斑馬魚幼魚感染模型的構(gòu)建。

為了了解重組菌 Mm927-pR2HYG（195 ±58 CFU）經(jīng)卵黃囊注射后在斑馬魚幼魚體內(nèi)的分布，我們在激光共聚焦顯微鏡下對感染 5 d 后的斑馬魚幼魚進(jìn)行觀察。圖2 結(jié)果顯示，重組菌Mm927-pR2HYG 感染斑馬魚 5 d 后，已經(jīng)從卵黃囊位置擴(kuò)散到了頭部、尾部以及腹部的區(qū)域。這個結(jié)果與已報道的野生型海分枝桿菌 927 株感染魚卵后使用抗酸性染色法觀察到的結(jié)果一致，進(jìn)一步明確了使用表達(dá)熒光蛋白的重組海分枝桿菌 927 株構(gòu)建斑馬魚幼魚感染模型的可行性。

2.2 應(yīng)用熒光像素計數(shù)法在幼魚感染模型中評價抗結(jié)核藥物的療效

為了初步驗證重組菌 Mm927-pR2HYG 感染模型是否可以用于抗結(jié)核藥物的藥效評價，本研究選擇一線抗結(jié)核藥物異煙肼和利福平分別處理感染了重組菌 Mm927-pR2HYG 的斑馬魚幼魚，同時以不給藥組作為對照，于感染后 5 d 用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像觀察，對藥物的給藥效果進(jìn)行評價。圖 3 結(jié)果顯示對照組斑馬魚體內(nèi)的海分枝桿菌分布全身，在腹部、頭部以及尾部都有大量表達(dá)紅色熒光蛋白的重組菌存在。而在用 2 mmol/L 異煙肼和 400 μmol/L 利福平分別處理的給藥組，斑馬魚體內(nèi)均沒有檢測到紅色熒光，說明這兩種藥物可以顯著抑制斑馬魚幼魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量，在該感染模型中具有明顯的抗結(jié)核療效。

圖 1 不同海分枝桿菌菌株對斑馬魚幼魚的致死作用（A：重組海分枝桿菌M 株感染斑馬魚后的生存曲線；B：重組海分枝桿菌927 株感染斑馬魚后的生存曲線）

Figure 1 Lethality of zebrafish infected by different recombinantstrains (A: Survival curve of zebrafish infected by recombinantM strain; B: Survival curve of zebrafish infected by recombinant927 strain)

圖 2 Mm927-pR2HYG 經(jīng)卵黃囊注射后在感染斑馬魚體內(nèi)的分布

Figure 2 The distribution of the recombinant strain Mm927-pR2HYG in the infected zebrafish by yolk sac injection

圖 3 激光共聚焦顯微鏡下觀察到抗結(jié)核藥物可以顯著抑制感染Mm927-pR2HYG 5 d 后斑馬魚模型中的細(xì)菌數(shù)量（A：對照組；B：異煙肼處理組；C：利福平處理組；放大倍數(shù)200 ×）

Figure 3 Mm927-pR2HYG can be significantly inhibited by anti-tuberculosis drugs in the zebrafish infection model. 5 days post infection, the distribution of Mm927-pR2HYG was detected by confocal microscopy (A: Control group; B: Isoniazid treatment group; C: Rifampicin treatment group; With magnification of 200)

圖 4 qPCR 計數(shù)法（A）和熒光像素計數(shù)法（B）在抗結(jié)核藥物藥效評價中的應(yīng)用和比較（*P < 0.05)

Figure 4 The application and comparison of qPCR counting method (A) and fluorescent pixel counting (B) in the evaluation of anti-tuberculosis drugs (*0.05)

為進(jìn)一步量化該斑馬魚感染模型幼魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量，消除熒光檢測的主觀性偏差，我們建立了目前國際上常用的熒光像素計數(shù)法，對感染 5 d 后的斑馬魚幼魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行半定量檢測；同時應(yīng)用我們之前已經(jīng)建立的基于 qPCR 的細(xì)菌計數(shù)法作為對照，通過比較兩種方法的藥效評價結(jié)果驗證其可靠性。如圖 4 結(jié)果所示，野生型海分枝桿菌 927 株感染斑馬魚 5 d 后，對照組中斑馬魚幼魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量經(jīng) qPCR 計數(shù)法計算可達(dá) 4 × 104CFU，而在 2 mmol/L 異煙肼和 400 μmol/L 利福平的藥物處理組，斑馬魚體內(nèi)的海分枝桿菌由于受到抗結(jié)核藥物的抑制，不再生長。同時在重組菌感染的斑馬魚對照組中，熒光像素值與藥物處理組相比也有顯著的增高，而異煙肼和利福平兩組的熒光像素值差別不大，與qPCR 計數(shù)法的結(jié)果一致，證明熒光像素計數(shù)法可以在重組菌 Mm927- pR2HYG 感染的斑馬魚模型中用于抗結(jié)核藥物的藥效評價。

3 討論

為了提高基于熒光檢測的海分枝桿菌感染斑馬魚模型的靈敏度和準(zhǔn)確度，我們構(gòu)建了毒力較弱的能夠表達(dá)紅色熒光蛋白的重組海分枝桿菌Mm927-pR2HYG，探討了其用于斑馬魚感染模型的可行性。通過受精卵卵黃囊注射感染后，重組菌 927 株與毒力較強的重組菌 M 株相比，具有相似的斑馬魚幼魚致死率，證明重組菌 Mm927- pR2HYG 可以有效地感染斑馬魚幼魚，適用于斑馬魚感染模型的構(gòu)建。同時卵黃囊注射相比傳統(tǒng)的尾靜脈注射，極大地提高了操作效率，為大規(guī)模體內(nèi)藥物篩選和評價提供了可能。

該感染模型結(jié)合熒光像素計數(shù)法可以半定量檢測斑馬魚體內(nèi)感染的細(xì)菌數(shù)量，與我們之前建立的 qPCR 計數(shù)法相比較，兩者對異煙肼和利福平的藥效評價結(jié)果具有一致性，證明了該模型應(yīng)用熒光像素計數(shù)法進(jìn)行藥效評價的可靠性。雖然該方法不能絕對定量感染的細(xì)菌數(shù)量，并且檢測窗口與 qPCR 計數(shù)法比相對狹窄，但是基于熒光檢測的感染模型可以更加簡便、直觀地對藥物的作用做出判斷，允許快速、連續(xù)和高通量的數(shù)據(jù)收集，更加適合高通量的抗結(jié)核藥物的篩選和評價。結(jié)合染色、病理組織切片以及 qPCR 計數(shù)法可以更加系統(tǒng)、深入地對藥物的給藥效果進(jìn)行分析。

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Application of fluorescent protein expressinginfected zebrafish in the evaluation of anti-tuberculosis drugs

YANG Guo-wei, PENG Shi-ze, ZHAO Jian-yuan, ZHANG Yong-xin, CEN Shan

Beijing Tropical Medicine Research Institute, Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100124, China (YANG Guo-wei); Department of Immunology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (PENG Shi-ze, ZHAO Jian-yuan, ZHANG Yong-xin, CEN Shan)

In order to improve the sensitivity and accuracy of the fluorescence-basedinfected zabrafish model, we constructed an attenuated recombinant strain Mm927-pR2HYG, which expresses red fluorescent protein, to establish a zebrafish infection model for the evaluation and screening of anti-tuberculosis drugs.

The recombinant strain Mm927-pR2HYG was infected into zebrafish by yolk sac injection and the lethality of the infected zabrafish and the distribution of Mm927-pR2HYG in the infected zabrafish were determined. Moreover, the therapeutic effects of isoniazid and rifampicin were evaluated by fluorescence pixel counting.

The Mm927-pR2HYG-zabrafish infection model was successfully constructed. The results showed that both isoniazid and rifampicin had good efficacy in this model. Both evaluation methods of fluorescence pixel counting and qPCR counting exhibited good consistency.

This study demonstrates that Mm927-pR2HYG-zabrafish infection model combined with fluorescence pixel counting is a rapid, efficient and visualevaluation system, which can be used for high-throughput screening of anti-tuberculosis drugs.

Zebrafish; Antitubercular agents; Drug evaluation; Recombinant Mycobacterium marinum; Fluorescence pixel counting

ZHANG Yong-xin, Email: yongxinzhang@imb.pumc.edu.cn; CEN Shan, Email: shancen@imb.pumc. edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.005

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康創(chuàng)新工程（2017-I2M-1-012 YXZ）

張永欣，Email：yongxinzhang@imb.pumc.edu.cn；岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

2019-03-25

*同為第一作者