補(bǔ)腎強(qiáng)身片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730000；

補(bǔ)腎強(qiáng)身片具補(bǔ)腎強(qiáng)身之功，君藥淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)，臣藥狗脊補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝，菟絲子補(bǔ)陽(yáng)益陰、固精縮尿、明目止瀉，佐藥女貞子滋腎明目，金櫻子固精止遺[1-2]。原標(biāo)準(zhǔn)中有顯微鑒別，化學(xué)反應(yīng)及淫羊藿TLC鑒別，未見(jiàn)含量檢測(cè)；相關(guān)文獻(xiàn)[3-7]多數(shù)只有淫羊藿TLC鑒別和單一成分的含量測(cè)定；個(gè)別文獻(xiàn)[8-10]對(duì)該成藥中的化學(xué)成分做了定性分析，并對(duì)其中6種化學(xué)成分進(jìn)行了定量分析。經(jīng)驗(yàn)證，原標(biāo)準(zhǔn)中淫羊藿TLC鑒別專屬性差，不能很好地重現(xiàn)，故改進(jìn)淫羊藿鑒別方法，同時(shí)新增菟絲子、金櫻子、女貞子的TLC鑒別，使其定性更準(zhǔn)確。其次，本研究選淫羊藿苷為替代對(duì)照品[11-12]同時(shí)測(cè)定處方中5個(gè)指標(biāo)成分的含量，以期在多組分含量測(cè)定過(guò)程中減少對(duì)照品的使用，為補(bǔ)腎強(qiáng)身片標(biāo)準(zhǔn)的制定提供更強(qiáng)有力的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Waters 2998(美國(guó)Waters)；不同色譜柱：Agilent 5 TC、SunFire TM、Capcell pak均柱為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器，HH-6)；十萬(wàn)分之一電子天平(MS205DU)、萬(wàn)分之一電子天平(ME204)均為瑞士梅特勒公司；超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器，KQ-500DE)；薄層色譜成像儀(瑞士CAMAG，Visualizer 2)。

1.2 材料 對(duì)照藥材：淫羊藿(121032-200501)、菟絲子(121232-201102)、女貞子(121041-200703)、金櫻子(121047-200302)及對(duì)照品：淫羊藿苷(110737-201516，94.2%)、金絲桃苷(111521-201205，93.3%)、原兒茶酸(110809-200604)、綠原酸(110753-201716，99.3%)、朝藿定C(111780-201804，92.6%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G板(青島海洋化工)；磷酸(分析純)；實(shí)驗(yàn)水(超純水)；甲醇、乙腈(進(jìn)口色譜純，99.9%)。補(bǔ)腎強(qiáng)身片(批號(hào)：1301、2301、3301、4301、5301、6301)及各藥材陰性樣品均由康縣獨(dú)一味生物制藥有限公司提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 淫羊藿TLC鑒別 ①樣品溶液的制備：各批次樣品約5 g，研細(xì)，25 mL乙醇水浴鍋回流半小時(shí)，放至常溫后過(guò)濾，蒸干濾液，加水35 mL少量多次溶解殘?jiān)扔靡颐演腿纱?20 mL/次)去除色素，水層再用乙酸乙酯萃取兩次(25 mL/次)，棄去水層，蒸干，2 mL乙醇溶解殘?jiān)吹谩＂趯?duì)照藥材溶液的制備：取1 g淫羊藿，同①項(xiàng)下處理，即得；另取適量淫羊藿苷，制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。③陰性樣品溶液的制備：取適量淫羊藿陰性粉末，同①項(xiàng)下處理，即得。吸取淫羊藿藥材5 μL，各批次樣品1 μL，淫羊藿苷3 μL，陰性樣品1 μL，點(diǎn)于G板上，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶2∶1∶1)展開(kāi)[13]，晾干后噴1%AlCl3試液，105℃烘干，紫外光下觀看。TLC圖顯示，在和對(duì)照同一位置可見(jiàn)黃色斑點(diǎn)，陰性樣品沒(méi)有影響。如圖1所示。

2.1.2 菟絲子的TLC鑒別 ①樣品溶液制備：各批次樣品約5 g，研細(xì)，置于三角瓶中，加40 mL甲醇回流半小時(shí)，放至常溫后過(guò)濾，蒸干，加水35 mL少量多次將殘?jiān)咳芙猓燃淄檩腿?次(20 mL/次)，三氯甲烷液蒸干，用1 mL三氯甲烷-無(wú)水乙醇(2∶3)混合液溶解殘?jiān)吹谩＂趯?duì)照藥材溶液制備：菟絲子1 g， 30 mL甲醇回流半小時(shí)，放至常溫后過(guò)濾，濾液濃縮至1 mL，即得。③陰性樣品溶液的制備：取適量菟絲子陰性粉末，同①項(xiàng)下處理，即得。吸取菟絲子藥材4 μL，陰性溶液2 μL，各樣品溶液4 μL，點(diǎn)于G板上，用三氯甲烷-甲醇(20∶0.5)展開(kāi)，晾干后噴磷鉬酸試液，110℃加熱顯色。TLC圖中，在菟絲子對(duì)照的對(duì)應(yīng)位置可看到同樣的綠色斑點(diǎn)(白光)，陰性樣品沒(méi)有影響。如圖2所示。

2.1.3 金櫻子的TLC鑒別 ①樣品溶液制備：各批次樣品約5 g，研細(xì)，置于三角瓶中，40 mL乙醇超聲半小時(shí)，濾過(guò)，蒸干，加水30 mL少量多次溶解殘?jiān)宜嵋阴ポ腿纱?25 mL/次)，棄去水液，蒸干， 2 mL甲醇溶解殘?jiān)吹肹13]。②對(duì)照藥材溶液制備：取1 g金櫻子，同①方式提取，即得。③陰性樣品溶液的制備：取適量金櫻子陰性粉末，同①項(xiàng)下處理，即得。吸取陰性溶液1 μL，金櫻子藥材1 μL，各樣品溶液6 μL，點(diǎn)于硅膠G板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶0.2∶0.2∶0.5)展開(kāi)，紫外光下觀察。TLC圖中，在金櫻子對(duì)照的對(duì)應(yīng)位置可看到同樣斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)影響。如圖3所示。

2.1.4 女貞子的TLC鑒別 ①樣品溶液：取金櫻子樣品溶液。②對(duì)照藥材溶液制備：取0.5 g女貞子，30 mL三氯甲烷超聲半小時(shí)，濾過(guò)，三氯甲烷液蒸干，2 mL甲醇溶解殘?jiān)吹肹13]。③陰性樣品溶液的制備：取適量女貞子陰性粉末，同“2.1.3”項(xiàng)下①處理，即得。吸取陰性溶液1 μL，各樣品溶液6 μL，女貞子藥材6 μL，點(diǎn)于G板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5∶5∶1∶1)展開(kāi)，噴10%硫酸乙醇，110℃加熱顯色。TLC圖中，在女貞子對(duì)照的對(duì)應(yīng)位置可看到同樣的紅褐色斑點(diǎn)，陰性樣品沒(méi)有影響。如圖4所示。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相：乙腈(B)-0.5%磷酸(C)；梯度洗脫：0～8 min，6% B；8～15 min，6%～11% B；15～23 min，11%～18% B；23～27 min，18%～21% B；27～33 min，21%～27% B；33～47 min，27% B；47～48 min，27%～6% B；48～60 min，6% B；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；波長(zhǎng)：270 nm。色譜圖如圖5所示。

2.2.2 對(duì)照溶液配制 用稱量舟分別精密稱取原兒茶酸16.30 mg， 21.51 mg，金絲桃苷18.96 mg，朝藿定C 20.31 mg，淫羊藿苷20.27 mg分別用甲醇定容至50 mL。另精密吸取原兒茶酸1 mL、綠原酸1 mL、金絲桃苷1 mL、朝藿定C 5 mL、淫羊藿苷4 mL于25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得濃度分別為0.01304 mg/mL、0.017087544 mg/mL、0.014151744 mg/mL、0.07522824 mg/mL、0.061101888 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 樣品溶液的制備 各批次樣品精密稱量1.0 g，置于三角瓶中，每批兩份平行樣，精密加25 mL稀乙醇，稱重，超聲1 h，冷卻后補(bǔ)足失重，混合均勻后靜置，取續(xù)濾液。

2.2.4 專屬性 取混合對(duì)照溶液10 μL、樣品溶液10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，在相應(yīng)保留時(shí)間，樣品和對(duì)照品相應(yīng)位置檢出色譜峰。如圖5所示。

2.2.5 線性關(guān)系 精密吸取5、7、9、10、11、13、15 μL混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定。縱坐標(biāo)(Y)為峰面積，橫坐標(biāo)(X)為進(jìn)樣量，得線性關(guān)系，見(jiàn)表1；各指標(biāo)成分線性關(guān)系圖，如圖6～10所示。

表1 線性關(guān)系表

2.2.6 精密度 精密吸取10 μL混合對(duì)照品溶液，連進(jìn)6針，測(cè)得各成分平均峰面積：原兒茶酸298642(RSD=0.30%)、綠原酸165236(RSD=0.30%)、金絲桃苷290493(RSD=0.30%)、朝藿定C 1499789(RSD=0.40%)、淫羊藿苷1302262(RSD=2.80%)，說(shuō)明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性 精密吸取10 μL樣品(批號(hào)：3301)溶液分別在0、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分峰面積RSD：原兒茶酸0.05%、綠原酸1.37%、金絲桃苷1.25%、朝藿定2.20%、淫羊藿苷2.69%，說(shuō)明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性 根據(jù)“2.2.3”方法取樣品(批號(hào)：3301)制備6份，按“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣檢測(cè)峰面積，計(jì)算峰面積RSD：原兒茶酸2.25%、綠原酸0.97%、金絲桃苷1.67%、朝藿定0.17%、淫羊藿苷2.87%，說(shuō)明該方法可行。

2.2.9 加樣回收率 精密稱取6份樣品(批號(hào)：3301)各0.5 g，研細(xì)，參照《中國(guó)藥典》2015年版四部9101指導(dǎo)原則[13]，根據(jù)各指標(biāo)成分含量，設(shè)置高、中、低濃度對(duì)照品加入量，使其與待測(cè)成分量之比控制在1.5∶1，1∶1，0.5∶1，按“2.2.3”項(xiàng)處理，進(jìn)樣測(cè)定各指標(biāo)成分峰面積并計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

續(xù)表2表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.10 相對(duì)校正因子的計(jì)算[11]以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)物，計(jì)算淫羊藿苷相對(duì)于原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、朝藿定C的校正因子，根據(jù)不同色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子，得出綜合校正因子，利用綜合校正因子間接計(jì)算原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷、朝藿定C的含量，校正因子f值見(jiàn)表3。

2.2.11 含量測(cè)定 按“2.2.1”項(xiàng)下條件，分別測(cè)定各批次補(bǔ)腎強(qiáng)身片樣品，每個(gè)批次平行測(cè)定2次，計(jì)算含量；同時(shí)采用替代對(duì)照品法計(jì)算其余4個(gè)成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 校正因子f值

3 討論

淫羊藿提取過(guò)程中增加了乙醚萃取步驟，研究發(fā)現(xiàn)在本試驗(yàn)中乙醚可有效去除淫羊藿藥材的色素，薄層顯色時(shí)使背景顏色降低，斑點(diǎn)更清晰可辨。金櫻子和女貞子共用同一個(gè)樣品提取液，調(diào)節(jié)展開(kāi)劑比例即可將二者鑒別，簡(jiǎn)化了樣品提取過(guò)程中的繁瑣步驟，節(jié)約了時(shí)間。進(jìn)行方法耐用性考察時(shí)，用不同廠家薄層板、不同溫度、不同濕度分別對(duì)其進(jìn)行展開(kāi)，結(jié)果表明，不同板子、溫度、濕度對(duì)TLC鑒別無(wú)太大影響，本研究方法可用于補(bǔ)腎強(qiáng)身片中各藥材的定性鑒別。

按含量測(cè)定項(xiàng)下方法：①超聲:20、30、40、50、60、70和80 min；②功率：100%、70%、50%；③溶劑：無(wú)水乙醇、50%乙醇、甲醇。結(jié)果功率100%+超聲60 min+50%乙醇峰面積最大，因此選用該條件。相關(guān)文獻(xiàn)[9]報(bào)道，特女貞苷為女貞子活性成分，本研究方法中特女貞苷不易檢出，可能是梯度洗脫未能將特女貞苷分離出來(lái)，也可能是所選的提取溶劑和提取方法未將樣品中的特女貞苷提取完全，故本文未曾列出特女貞苷含量測(cè)定。本試驗(yàn)曾嘗試梯度洗脫的同時(shí)采用切換波長(zhǎng)的方法采集各指標(biāo)成分色譜峰，以期在各指標(biāo)成分波長(zhǎng)最大吸收處測(cè)定其含量，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，切換波長(zhǎng)會(huì)使樣品基線發(fā)生漂移，不利于各指標(biāo)成分含量測(cè)定，由于各指標(biāo)成分在270 nm處均有紫外吸收，故最終選擇單波長(zhǎng)270 nm為其測(cè)定波長(zhǎng)。

試驗(yàn)選擇淫羊藿苷為替代對(duì)照品，利用相對(duì)校正因子同時(shí)測(cè)定5種成分含量；同時(shí)用不同色譜柱對(duì)校正因子進(jìn)行考察，條件允許的情況下建議使用不同的儀器、色譜柱、柱溫及檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步考察，使相對(duì)校正因子更加準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)論

綜上所述，該試驗(yàn)在中藥成方制劑的基礎(chǔ)上改進(jìn)了淫羊藿的薄層鑒別，同時(shí)新增菟絲子，女貞子，金櫻子的薄層鑒別，確保了鑒別工作的準(zhǔn)確性。由表4可看出，兩種方法所測(cè)定的指標(biāo)成分含量并無(wú)太大差別，說(shuō)明替代對(duì)照品法可用于該中藥制劑的含量測(cè)定，為中成藥多指標(biāo)含量測(cè)定在節(jié)省對(duì)照品使用方面提供了新思路。