紅花偽品及其染色物的檢測探討

山西省晉城市食品藥品檢驗所，山西 晉城 048000

紅花始載于《開寶本草》，原名“紅藍花”[1]。中華人民共和國藥典規定其來源為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，具有活血通經，散瘀止痛之功效[2]。主治婦女月經不調、痛經閉經，還適用于各種靜脈曲張、末梢神經炎、跌打損傷、關節酸痛、腿腳麻木等癥。紅花為臨床常用品種，由于用途廣泛，貨源緊張，導致價格上漲，為賣相好看或造假，市場上摻偽染色現象時有發生，如有報道紅花飲片被酸性紅73、日落黃染色[3-4]，嚴重影響藥品療效，危害人類健康。近期筆者在日常工作中發現一種紅花的偽品，大小和顏色與紅花較為相似。為有效打擊這種違法行為，提供有力證據，本文首先從性狀入手，輔以水試，對紅花與其偽品進行了鑒別，同時發現可能有非法染色物存在，進而通過HPLC法對染色物質進行了定性，并應用HPLC-MS法對染色物質做了進一步的確認，證實該偽品中含有胭脂紅。對染色物確證時，采用了多反應監測和二級全掃描相結合的模式與相應的對照品進行比較，得出的結論更加可靠，以供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 OLYMPUS 520 照相機；OLYMPUS SZX7體式顯微鏡；Waters 2695高效液相色譜儀(2998二極管陣列檢測器，美國Waters)；Waters AcQuity uplc XEVO TQD 高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀(美國Waters公司)；AUW120D型電子分析天平(日本島津)；BRANSONIC 超聲波清洗機(美國BRANSON)；Medium-s300超純水器(四川優普超純科技有限公司)。

1.2 材料 胭脂紅(批號：111771-201302)、檸檬黃(批號： 510004-201602)、金橙Ⅱ(批號：111769- 201302)、偶氮玉紅(批號：520054-201401)、酸性紅73(111773-201602)、日落黃(批號：510005-201602)等以上標準物質均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

實驗用紅花正品藥材為2018年6月于市場收集；紅花偽品為2018年7月抽檢樣品，實驗樣品均保存于晉城市食品藥品檢驗所標本室。

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別 采用OLYMPUS SZX7體式顯微鏡觀察微觀形態特征，比較紅花與其偽品的不同點，然后采用水試的方法，觀察入水前后兩者的差異以及水的顏色變化。紅花為不帶子房的管狀花，長1～2 cm，表面紅黃色或紅色。花冠筒細長，先端5裂，裂片呈狹條形，長5～8 mm；雄蕊5，花藥聚合成筒狀，黃白色；柱頭長圓柱形，頂端微分叉。質柔軟。偽品與紅花正品外觀較為相似，表面橙紅色，花藥顏色為橙紅色，質松脆。如圖1所示。

2.2 水試 取紅花及其偽品少許，分別加水25 mL，浸漬數分鐘，濾液置于比色管中，日光下檢視，紅花濾液顯淡黃色，偽品濾液顯橙紅色。將浸漬后的紅花及偽品置于白紙上，日光下觀察，紅花顏色沒有發生變化，偽品顏色退去，變成淡棕色。如圖2、3所示。

2.3 HPLC-DAD法偽品染色物質的檢測

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters XTERRA MS C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相A(甲醇)-B(0.01 mol/L乙酸銨溶液)按表1進行梯度洗脫；柱溫30℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：508 nm；二極管陣列檢測器檢測波長范圍：200～700 nm。

2.3.2 供試品溶液制備 分別取紅花與其偽品的粉末 0.1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理 20 min，濾過，取上清液作為供試品溶液。

2.3.3 對照品溶液的制備 取胭脂紅對照品適量，加甲醇制成每1 mL含胭脂紅60 μg的對照品溶液。

2.3.4 樣品測定 取紅花供試品溶液、紅花偽品供試品溶液，以及對照品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.3.5 HPLC-DAD法結果 結果表明紅花偽品供試品溶液中呈現與胭脂紅對照品溶液保留時間一致的色譜峰，且對照品和供試品中相應色譜峰在200～700 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜相同。如圖3、4所示。

2.4 HPLC-MS法檢測

2.4.1 色譜-質譜條件 色譜柱：waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相A(甲醇)-B(0.01 mol/L乙酸銨溶液)按表2進行梯度洗脫；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL。質譜條件離子源：電噴霧ESI；電離方式：ESI+ ；電噴霧電壓：0.7KV；離子源溫度：500℃；載氣流速：1000 L/H。掃描方式：多反應監測掃描、 二級質譜全掃描，掃描范圍m/z 50～550，具體質譜參數見表3。

表1 HPLC-DAD 梯度洗脫條件

表2 HPLC-MS 梯度洗脫條件

表3 化合物的基本信息及MRM參數

注：二級質譜全掃描錐孔電壓為36V，碰撞能量為30eV

2.4.2 供試品溶液制備 取紅花偽品的粉末 0.1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理 20 min，濾過，取上清液作為供試品溶液。

2.4.3 對照品溶液的制備 取胭脂紅對照品適量，加甲醇制成每1 mL含胭脂紅60 μg的對照品溶液。

2.4.4 樣品測定 取空白試劑、紅花偽品供試品溶液，對照品溶液分別稀釋適當的倍數后進樣，進行液相色譜-質譜聯用分析。

2.4.5 HPLC-MS法結果 多反應監測掃描質譜圖中，紅花偽品出現與胭脂紅對照試劑保留時間一致的準分子離子峰；在二級全掃描質譜圖中，紅花偽品出現與胭脂紅對照試劑相同的離子碎片特征峰，進一步確證了紅花偽品供試品種中添加有胭脂紅色素(多反應監測質譜圖、二級質譜圖詳見圖5、6)。胭脂紅的準分子離子[M-3Na+4H]+ 峰為m/z 539，其二級全掃描質譜的特征離子碎片為 158.13、223.00、316.08。

3 討論

3.1 紅花偽品的鑒別 研究發現偽品紅花與正品紅花性狀差別主要體現在兩個方面，一是質感，正品紅花質地柔軟，整體性好；偽品紅花質地則較為松脆，整體性差，易散碎。二是花藥，正品紅花的花藥顏色為黃白色，明顯比外側花瓣顏色淺；偽品紅花的花藥顏色為同外側花瓣顏色一樣為橙紅色。分析認為這種現象是由于偽品經統一染色導致花瓣花藥顏色均為橙紅色，可以作為鑒別該偽品的關鍵特征。基于以上結論，本文可為基層執法提供一種快速鑒別可疑偽品的便利方法，尤其是在沒有攜帶相關快速檢測設備的情況下，可抓住此性狀特征，對可疑品種第一時間進行控制，防止非法流通，具有一定社會效益。

3.2 染色物的檢測 采用水試法，發現紅花偽品入水后，褪色，懷疑其被染色，參考藥品補充檢驗方法(國家食品藥品監督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件：2013007、2014016)對方法中涉及的色素進行檢測，首先應用薄層色譜方法對偶氮玉紅、酸性紅73、日落黃、檸檬黃、胭脂紅和金橙Ⅱ等6種染色物質進行了初篩，并在偽品供試品中檢測到胭脂紅種染色物質。在此基礎上，參考相關文獻報道的方法[5]，應用了HPLC-DAD和HPLC-MS的方法對偽品中染色物質做了進一步的確認，證實偽品中含有胭脂紅。胭脂紅與歐盟標準禁用的蘇丹紅Ⅰ同屬于偶氮類色素，毒理學實驗顯示其有一定的致癌和突變作用，如果人在不知情的情況下長期使用了這種染色的紅花，容易引起暫時性或持久性的病理狀態，甚至危及生命，在藥品中是不允許添加的。為此，本文建立的HPLC以及HPLC-MS方法，能夠檢測紅花偽品中所摻入的胭脂紅色素，為紅花和其他藥材中非法使用胭脂紅的檢測提供參考，同時也為藥材中其他染色成分的檢測提供借鑒，為大力打擊中藥染色這種違法行為提供技術支撐，確保中藥質量，保證臨床用藥安全有效。

對紅花偽品測定的同時，對紅花正品和空白試劑也進行了考察，紅花正品溶液和空白試劑在相應色素色譜峰位置均未出現干擾峰，表明本文所建立的對胭脂紅色素檢測的HPLC和HPLC-MS法專屬性良好。參考文獻[6-9]，對藥品中違法添加色素的檢測，通常最終采用液質聯用法進行檢出物的確認，具體方法是通過與對照品的一級質譜、二級質譜相比較，查看是否一致。本文采用多反應監測和二級全掃描相結合的模式進行測定，由于多反應監測可以通過對兩級離子的選擇，排除大量的干擾離子，降低了檢測背景，所以本模式可以提高檢測的靈敏度和準確度，為藥品中色素類成分的檢測提供新的思路。

綜上，通過對一種紅花偽品的鑒別，發現與正品紅花有明顯的性狀差異，根據此鑒別點能夠迅速進行初篩，可以用于快檢；同時經過水試分析及現代分析儀器檢測，發現了紅花偽品中違法添加胭脂紅染色物質，實驗結果顯示所建立的用于測定胭脂紅的HPLC以及HPLC-MS方法專屬性好，靈敏度高，可以為胭脂紅以及其他染色物質的檢測提供參考。