人參內生菌B69菌株抑菌物質特性的研究

林星辰　田義新　王澤　牛林飛

摘要：研究人參內生細菌B69菌株對人參根腐病病原菌的作用機制，通過硫酸銨沉淀、低溫乙醇沉淀等方法獲得菌株發酵液中活性成分，對其抑菌物質粗提液進行穩定性測定，并對其抑菌成分進行分離，采用平板擴散法測定提取成分的抑菌活性。結果表明，從B69菌株發酵液得到的提取液具有抑菌活性;對抑菌物質粗提物進行高溫、酸堿度、紫外線、反復凍融和蛋白酶K處理，抑菌活性均未見明顯變化。從B69發酵液中初步分離出具有抑制根腐菌活性的活性肽和胞外多糖。表明B69菌株能產生多種抑菌活性成分，抑菌成分對脅迫條件不敏感，值得進一步開發利用。

關鍵詞：人參;內生細菌;B69菌株;人參根腐病;抑菌物質

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0167-04

人參（Panax ginseng C. A. Meyer）屬五加科多年生草本植物，是傳統的名貴中藥材。在我國東北地區已經形成規模化種植[1]。人參病害一直是影響人參質量最主要的因素之一，其中人參根腐病是常見的人參土傳病害，人參根腐病主要侵染人參的根部，造成根部軟化腐爛，危害嚴重且防治相當困難[2]。在人參栽培中根腐病發病率最高可達50%，可造成巨大的經濟損失[3]。

內生細菌在宿主植物中具有豐富的多樣性，在與宿主植物長期協同進化的過程中形成了特殊的共生關系[4-5]。因此人參內生菌資源的開發用于人參病害的生物防治，對環境保護和人參質量的提高都有巨大意義。目前人參內生菌的報道多集中在內生菌分離和次生代謝產物的研究上，對植物病害的防治報道較少，人參內生菌這一重要的資源有待于開發。姜云等分離得到的人參內生菌對人參根腐病病菌（Fusarium solani）等多種人參病原真菌具有明顯的抑制作用[6]。本試驗通過對人參內生細菌B69菌株分泌液中代謝產物進行分離提取，以期明確B69菌株合成的抑菌活性成分組成情況及其抑菌活性的穩定性，為人參的病害防治奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株B69由筆者所在課題組從人參根中分離得到，經劉學周等鑒定為死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）[7]。活性指示菌根腐病病菌，由吉林農業大學農學院植物病理教研室提供。

1.1.2 供試培養基 供試細菌的保存和培養使用營養瓊脂（NA）培養基;供試細菌液體發酵培養使用營養肉湯（NB）培養基;病原真菌分離培養使用馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基。

1.1.3 試驗時間地點 菌株抑菌物質特性試驗于2017年4—7月在吉林農業大學藥用植物實驗室進行。

1.2 抑菌物質粗提物的制備及抑菌活性測定

B69菌株的發酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心 20 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到抑菌物質粗提液，備用。抑菌活性用平板擴散法測定。

1.3 抑菌物質粗提物穩定性的測定

溫度、pH值、蛋白酶、紫外線、反復凍融等穩定性試驗參考文獻[8]。

1.4 有機溶劑萃取物制備及其抑菌活性

取4支試管加抑菌物質粗提液，向其中分別加入等體積的有機溶劑（三氯甲烷、乙醚、乙酸乙醚、丙酮）進行萃取。待萃取液分層后，將水相與有機相進行分離，水相部分經 0.22 μm 微孔濾膜過濾。分別測定水相和有機相提取液的抑菌活性，以有機溶劑為空白對照，試驗重復3次。72 h后測定其對根腐病病菌的抑菌圈大小。

1.5 抑菌蛋白成分的提取及其抑菌活性檢驗

1.5.1 硫酸銨沉淀法 在抑菌物質粗提液中加入硫酸銨，使其最終飽和濃度分別達到30%、40%、50%、60%、70%、80%，混勻，于4 ℃靜置24 h。以飽和濃度為80%的培養液作為對照。在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，分別收集上清液和沉淀，沉淀溶于緩沖液中，測定沉淀和上清液的抑菌活性。

1.5.2 低溫乙醇沉淀法 將無水乙醇提前放入冰箱進行預冷處理。在0 ℃冰浴中向抑菌物質粗提液中緩慢加入乙醇使其在溶液中的終濃度分別為50%、60%、70%、80%。于 4 ℃ 靜置6 h以上，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，分別收集沉淀和上清液，將沉淀溶于磷酸鹽（PBS）緩沖液中，所得沉淀即為蛋白粗提液。測定上清液和沉淀的抑菌活性，以濃度為80%的乙醇培養液作同樣的處理為對照。取乙醇上清液和沉淀溶解液各1.5 mL，在4 ℃水浴中加熱20 min后，測定抑菌活性。

1.6 脂肽粗提取物的制備及其抑菌活性檢驗

取10 mL NA發酵上清液，用6 mol/L HCl調節pH值至2.0，4 ℃靜置12 h，10 000 r/min離心20 min。所得上清液用NaOH調節pH值為中性后4 ℃保存備用。將沉淀用甲醇溶解，抽濾3次，合并濾液，旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥，所得干燥樣品用PBS緩沖液（0.02 mol/L，pH值為7.2）定容至10 mL，經0. 22 μm濾膜除菌，即得脂肽粗提物。檢測脂肽粗提液和上清液的抑菌活性，以發酵上清液為陽性對照，以無菌PBS緩沖液為空白對照，試驗重復3次。

1.7 胞外多糖的提取及測定

1.7.1 提取過程 將B69菌株發酵液稀釋3倍，在 10 000 r/min 條件下離心10 min，棄菌體，收集離心液。以Sevag法去除蛋白質[9]，處理過程如下：由正丁醇和三氯甲烷以1 ∶4的體積比配制Sevag液，將其按4 ∶1的體積比加入離心液中，振蕩25 min，6 000 r/min離心10 min，棄沉淀，反復處理3次，得到去除蛋白的離心液。向離心液中加乙醇來沉淀多糖，以空白培養液作同樣處理為對照。用BaCl2溶液檢測是否將SO42-徹底去除，用碘-碘化鉀反應檢測是否將培養基中的淀粉徹底去除。

本試驗對人參內生菌B69菌株抑菌物質的特性進行了研究。穩定性試驗結果表明，人參內生菌B69菌株產生的抑菌物質粗提液耐強酸強堿、對蛋白酶不敏感，紫外線照射和反復凍融對其活性沒有明顯影響。該菌株分泌的胞外抑菌物質可以被乙醇部分沉淀，但不能被硫酸銨沉淀。抑菌物質提取液經100 ℃處理后，部分失活，乙醇處理后的上清液耐高溫。沉淀經100 ℃處理20 min后失活。從B69菌株中得到的粗脂肽提取物具有抑菌活性并且其胞外多糖也具有抑制根腐病病菌的作用，因此目前可知該植株可以至少產生2種抑菌物質。

本試驗中得到的多肽具有抑菌活性，近年來，微生物來源的多肽被用于抗真菌病害方面的研究也有很大的進展，它與化學農藥相比污染少、對環境友好，在農業生物防治領域具有廣闊的應用前景。

近年來，在植物保護領域，多糖被用來誘導植物的抗性防衛反應，如誘導過氧化物酶和幾丁質酶的積累，提高植物的抗病能力，或者直接抑制植物病原菌[15]，多糖研究正越來越多地引起人們關注[16]。本試驗從B69菌株中提取出的胞外多糖能夠抑制根腐病病菌的生長，極具研究價值。

本試驗在對B69菌株開展抑菌活性研究的基礎上，就其次生代謝產物中的抑菌活性成分也開展了初步研究，基本明確了抑菌活性物質的活性部位，這為菌株抑菌活性物質的分離純化、結構鑒定及抑菌機制研究奠定了良好基礎;另外，上述試驗結果的獲得也將有助于推動人參病害的生物防治。

參考文獻：

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