8種禾本科牧草低溫脅迫的生理響應及抗寒性比較

2019-08-20 13:46:50雷雪峰馬愛生李海翠王彩艷劉紅媛

江蘇農業科學 2019年9期

雷雪峰　馬愛生　李海翠　王彩艷　劉紅媛

摘要：以來自內蒙古、寧夏、甘肅、新疆、四川、西藏等不同地區的8種禾本科牧草幼苗為材料，分別在15、5、0、-5 ℃ 下對其進行低溫脅迫處理，研究其葉片細胞膜透性、丙二醛（MDA）含量、過氧化物酶（POD）活性、游離脯氨酸（Pro）及可溶性蛋白含量等生理生化指標對低溫脅迫的響應。結果表明，隨著低溫脅迫加劇，8種禾本科牧草細胞膜透性、MDA含量總體呈現逐漸上升的趨勢，不同物種上升幅度存在差異;而在POD活性、Pro及可溶性蛋白含量方面，不同物種間變化幅度差異較大。通過隸屬函數法綜合評價得出8種牧草抗寒性表現為細莖冰草>老芒麥> 沙生冰草>蒙古冰草>多變鵝觀草>冰草>黑藥鵝觀草>大芒鵝觀草。

關鍵詞：禾本科牧草;低溫脅迫;生理響應;抗寒性

中圖分類號： Q945.78文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0218-05

我國擁有近4億hm2的天然草地[1-2]，但由于全球氣候變化及人類對草地不合理的開發利用，已普遍造成不同程度的草地退化，生產力嚴重下降[3-4]。再加上近年來草地超載過牧嚴重，草畜矛盾日益加劇，嚴重地制約著當地畜牧業的快速發展[5]。只靠利用天然草地的養殖方式，已經不適應現代畜牧業生產快速發展的要求[6]。輔助人工草地建設是解決草畜矛盾、改善生態環境的重要手段。在我國北方草原地區，能否正常越冬是制約人工草地建植的關鍵問題，因此亟需篩選抗寒性較強的牧草品種用于人工草地建植[7]。

禾本科牧草具備產量高、品質好、適口性強、適應性廣等特點，在草地畜牧業中發揮重要作用[8]。目前雖然對禾本科牧草抗逆性研究報道較多[9-12]，但對其跨區域的種間抗寒性評價研究報道則相對較少。因此，本研究擬對來自內蒙古、寧夏、甘肅、新疆、四川、西藏等不同地區的8種禾本科牧草幼苗進行不同強度的低溫脅迫，分析其各相關生理指標的變化情況，通過綜合分析，進一步對其進行抗寒性評價，旨在為在我國范圍內跨區域挖掘禾本科牧草抗寒材料，以及為寒區人工草地建植適宜品種篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自于6個地區，包括禾本科3個屬8個種，材料具體情況見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

試驗于2016年9月至2017年1月在內蒙古農業大學農學院進行。試驗采用盆栽育苗法，苗盆直徑為12 cm、高為15 cm，栽培基質為農田土和蛭石，兩者體積比為 2 ∶1，苗盆內裝入等體積的混合栽培基質，播種量為50粒/盆，盆栽材料全部置于25 ℃（白天）/20 ℃（晚上）的人工氣候箱內培養。待苗高達10 cm時進行低溫脅迫，脅迫設置4個水平（15、5、0、-5 ℃），并以室溫（25 ℃）作對照，每個處理3次重復，各溫度脅迫時間為3 d。處理結束后，立刻剪取葉片稱質量，并用液氮迅速冷凍，放入-70 ℃低溫冰箱中保存備用。

1.2.2 試驗測定指標

細胞膜透性測定采用電導儀法;丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸顯色法;游離脯氨酸[HJ1.4mm]（Pro）含量測定采用茚三酮顯色法;過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚氧化比色法;可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法。

1.3 抗寒性綜合評價

抗寒性評價采用Fuzzy數學中隸屬函數法進行綜合分析，其計算公式如下：

與抗寒性呈正相關的參數（POD活性、可溶性蛋白含量

和Pro含量）采用公式（1）：

U（Xijk）=（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（1）

與抗寒性呈負相關的參數（細胞膜透性、MDA含量）采用公式（2）：

U（Xijk）=1-（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（2）

式中：U（Xijk）為第i個禾本科牧草第j個溫度階段第k項指標的隸屬度，且U（Xijk）∈[0，1];Xijk表示第i個禾本科牧草第j個溫度階段第k項指標的測定值;Xmax、Xmin分別為所有參試材料中第k項指標的最大值、最小值。運用公式（1）、公式（2）求出不同溫度處理下各禾本科牧草各指標參數的隸屬函數值，再將其累加起來求其平均值，得出此指標的綜合評價值。綜合評價值越大，則其抗寒性越強。

1.4 數據分析

用Excel軟件進行數據整理和作圖，用SPSS 18.0軟件進行方差分析、多重比較和抗寒性的隸屬函數分析。

2 結果與分析

2.1 禾本科牧草幼苗葉片的細胞膜透性變化

如圖1所示，隨低溫脅迫加劇，8種禾本科牧草幼苗葉片細胞膜透性總體呈現逐漸上升的趨勢，表明其細胞膜傷害程度逐漸加深。各低溫脅迫與對照（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片細胞膜透性存在一定差異。在15 ℃條件下，除多變鵝觀草及老芒麥外，其他6種牧草葉片細胞膜透性與對照相比，差異均達到顯著水平（P<0.05）。在5 ℃條件下，除多變鵝觀草外，其他7種牧草幼苗葉片細胞膜透性與對照相比，差異均達到顯著或極顯著水平。之后，隨著脅迫的加劇，各牧草幼苗葉片細胞膜透性與對照相比，差異均達到極顯著水平（P<0.01）。其中，在0 ℃條件下，大芒鵝觀草葉片細胞膜透性增幅最大，為192.6%，多變鵝觀草葉片細胞膜透性增幅最小，為39.0%;在-5 ℃條件下，冰草葉片細胞膜透性增幅最大，為356.6%，多變鵝觀草葉片細胞膜透性增幅最小，為68.4%。上述分析表明，低溫脅迫對多變鵝觀草和老芒麥幼苗葉片細胞膜的傷害程度較小，對冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片細胞膜的傷害程度較大。

2.2 禾本科牧草幼苗的丙二醛（MDA）含量變化

如圖2所示，隨低溫脅迫加劇，8種禾本科牧草幼苗葉片MDA含量總體呈現逐漸上升的趨勢，表明其細胞膜脂過氧化程度逐漸加深。各低溫脅迫與對照（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片MDA含量存在一定差異。在15 ℃及5 ℃條件下，除沙生冰草、細莖冰草及多變鵝觀草外，其他5種牧草葉片MDA含量與對照相比，差異均達到顯著或極顯著水平。在 0 ℃ 條件下，沙生冰草及多變鵝觀草葉片MDA含量與對照相比，差異達到顯著（P<0.05）水平，其他6種牧草達到極顯著（P<0.01）水平，其中大芒鵝觀草和冰草MDA含量的增幅最大，分別為302.0%、200.0%。在-5 ℃條件下，各牧草葉片MDA含量與對照相比均達到極顯著（P<0.01）水平，其中，大芒鵝觀草和冰草MDA含量的增幅最大，分別為676.4%、490.0%，沙生冰草和細莖冰草MDA含量的增幅最小，分別為216.7%、106.3%。上述分析表明，低溫脅迫下沙生冰草和細莖冰草幼苗葉片膜脂過氧化程度較低，大芒鵝觀草和冰草幼苗葉片膜脂過氧化程度較高。

2.3 禾本科牧草幼苗的過氧化物酶（POD）活性變化

如圖3所示，隨著低溫脅迫加劇，黑藥鵝觀草和老芒麥幼苗葉片POD活性呈現逐漸上升的趨勢，其他6種牧草幼苗葉片POD活性呈現先上升后下降的趨勢，其中細莖冰草、冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片POD活性峰值出現在脅迫溫度為 5 ℃ 時，沙生冰草、蒙古冰草及多變鵝觀草幼苗葉片POD活性峰值出現在脅迫溫度為0℃時。各低溫脅迫處理與對照

（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片POD活性存在一定差異。在15 ℃條件下，細莖冰草、黑藥鵝觀草和多變鵝觀草幼苗葉片POD活性與對照相比，差異均達到極顯著水平（P<0.01），其他5種牧草與對照相比差異不顯著。在5 ℃條件下，8種牧草間幼苗葉片POD活性與對照相比均達到極顯著水平（P<0.01）。在0 ℃條件下，細莖冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片POD活性與對照相比，差異不顯著，其他6種牧草與對照相比差異仍到達極顯著水平（P<0.01）。在-5 ℃條件下，冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片POD活性與對照相比，差異不顯著，其他6種牧草與對照相比差異仍到達極顯著水平（P<0.01）。上述分析表明，低溫脅迫下，冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片POD活性響應較小。

2.4 禾本科牧草幼苗的游離脯氨酸（Pro）含量變化

如圖4所示，隨低溫脅迫加劇，冰草和大芒鵝觀草葉片Pro含量呈現先上升后下降的趨勢，其他6種禾本科牧草幼苗葉片Pro含量呈現逐漸上升的趨勢。各低溫脅迫與對照（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片Pro含量存在一定差異。在15 ℃條件下，除沙生冰草、細莖冰草、蒙古冰草、大芒鵝觀草及多變鵝觀草外，其他3種牧草葉片Pro含量與對照相比，差異均達到極顯著水平（P<0.01）。在5 ℃條件下，除大芒鵝觀草外，其他7種牧草幼苗葉片Pro含量與對照相比，差異均達到極顯著（P<0.01）水平。之后，隨著脅迫的加劇，各牧草幼苗Pro含量與對照相比，差異均達到極顯著水平（P<0.01），其中，在0 ℃條件下，細莖冰草和老芒麥葉片Pro含量增幅最大，分別為173.69%、164.10%，沙生冰草和冰草葉片Pro含量增幅最小，分別為69.50%、65.67%;在-5 ℃條件下，細莖冰草和多變鵝觀草葉片Pro含量增幅最大，分別為226.73%、207.50%，冰草和大芒鵝觀草葉片Pro含量增幅最小，分別為34.24%、65.36%。上述分析表明，低溫脅迫下，沙生冰草、細莖冰草、多變鵝觀草和老芒麥幼苗葉片Pro含量響應較大，冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片Pro含量響應較小。

2.5 禾本科牧草幼苗的可溶性蛋白含量變化

如圖5所示，隨著低溫脅迫加劇，細莖冰草、冰草、蒙古冰草、大芒鵝觀草和老芒麥幼苗葉片可溶性蛋白含量總體呈現逐漸上升的趨勢，其他3種牧草幼苗葉片可溶性蛋白含量呈現先上升后下降的趨勢，其中沙生冰草和多變鵝觀草幼苗葉片可溶性蛋白含量峰值分別出現在脅迫溫度為5、15 ℃時，黑藥鵝觀草幼苗葉片可溶性蛋白含量峰值出現在脅迫溫度為 0 ℃ 時。各低溫脅迫與對照（25 ℃）相比，8種牧草間幼苗葉片可溶性蛋白含量存在一定差異。在15 ℃條件下，除沙生冰草和冰草外，其他6種牧草幼苗葉片可溶性蛋白含量與對照相比，差異均達到極顯著水平（P<0.01）。在之后的脅迫溫度下，所有材料幼苗葉片可溶性蛋白含量與對照相比，差異均達到極顯著水平（P<0.01）。其中，在5、0、-5 ℃條件下，細莖冰草幼苗葉片可溶性蛋白含量增幅均最大，分別為134.3%、153.0%、173.9%，增幅較大的還有蒙古冰草，而冰草（27.9%、50.1%、54.6%）和老芒麥（35.6%、32.4%、61.2%）增幅最小，但其對照基數較大。

2.6 8種禾本科牧草幼苗抗寒性綜合評價

植物的抗寒性強弱是多種因子綜合作用的結果，因此，為了全面準確地評價供試材料的抗寒性，采用隸屬函數法得出各材料各指標的隸屬函數值，進一步求得各材料平均隸屬度，該值越大，抗寒性越強，反之抗寒性越弱。根據平均隸屬度（表2）得出8種禾本科牧草的抗寒性表現為細莖冰草>老芒麥> 沙生冰草>蒙古冰草>多變鵝觀草>冰草>黑藥鵝觀草>大芒鵝觀草。

3 討論與結論

3.1 禾本科牧草低溫脅迫的生理響應

低溫脅迫下，植物會發生一系列異常的生理生化反應，其主要表現在細胞膜透性、活性氧含量、抗氧化酶活性及滲透調節物質含量等的改變上，這些變化都是植物受到低溫脅迫后的傷害體現或應對反應[13-15]。

低溫脅迫對植物的傷害，首先表現為葉片細胞膜系統受損，生物膜透性增加，電解質外滲，電導率增大[16]。同時體內活性氧的平衡被打破，導致膜質過氧化程度加劇，從而膜質過氧化產物丙二醛含量增加。大量研究結果表明，隨著低溫脅迫強度的增加，早熟禾（Poa annua L.）、黑麥草（Lolium perenne L.）、高羊茅（Festuca elata Keng）[17-18]、老芒麥、偃麥草[Elytrigia repens （L.） Nevski.][19]及其他草坪草[20]等禾本科牧草的相對電導率、細胞傷害率及MDA含量都在增大，只是不同的物種變化程度不同。本研究結果與前人研究結果[17-20]一致，隨低溫脅迫加劇，供試的8種禾本科牧草幼苗葉片細胞膜透性及MDA含量總體呈現逐漸上升的趨勢，表明其細胞膜傷害程度逐漸加深。低溫脅迫對多變鵝觀草和老芒麥幼苗葉片細胞膜傷害程度較小，對冰草和大芒鵝觀草幼苗葉片細胞膜傷害程度較大、膜脂過氧化程度較高。

低溫脅迫下，植物體通過調節保護酶活性，清除體內過剩的活性氧自由基，減少有害物質大量積累，進而提高植物抗寒能力[21]。張尚雄等對3個披堿草屬（Elymus spp.）牧草的抗寒性研究表明，隨著低溫脅迫的加劇，保護酶SOD、POD活性隨之逐漸增強，不同抗寒性品種間保護酶活性增加幅度不同[22]。但楊順強等對從美國引進的5種禾本科牧草研究表明，不同溫度處理下其根系SOD、CAT、POD的活性變化因種而異，大部分草種均是在冷凍處理后降到最低，返青后才有所回升[23-24]。本研究結果表明，隨著低溫脅迫加劇，黑藥鵝觀草和老芒麥幼苗葉片POD活性逐漸上升，其他6種牧草幼苗葉片POD活性呈現先上升后下降的趨勢。可見，低溫脅迫下，禾本科牧草保護酶活性的變化趨勢，與物種的遺傳特性、生存環境、低溫脅迫的強度以及組織器官等因素有關。

在干旱、低溫、高溫、鹽漬等各種逆境下，植物體均體現出水分脅迫的特征，多數植物可主動積累滲透調節物質來提高細胞液濃度，降低滲透勢，提高細胞吸水或保水能力，從而適應逆境脅迫。在抗寒性評價研究中，采用較多的滲透調節物質主要有脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖，其中可溶性蛋白質含量、脯氨酸含量與低溫脅迫關系的研究目前存在2種觀點：一種支持低溫導致植物細胞中該物質含量變化趨勢是逐漸增加的;另一種認為該物質含量在抗冷過程中并不會發生改變，或者與植物抗冷性的增強并不存在因果關系[25]。本研究結果支持前一種觀點，即隨著低溫脅迫強度加劇，供試材料的滲透調節物質表現為逐漸增加，只是部分材料在低溫脅迫后期滲透調節物質增加幅度降低。

3.2 植物抗寒性的綜合評價

不同的物種，其遺傳特性各異，對環境的適應方式不同，導致其抗寒機制存在差異[26-27]。從報道的文獻來看，抗寒性指標主要有形態指標、生理生化指標、分子指標等[28]。但對植物進行抗寒性綜合評價時，絕大多數學者還是采用生理生化指標。不同指標對植物抗寒性的貢獻率不盡相同，正確評判各指標的貢獻率，是植物抗寒性綜合評價的關鍵[29-30]。因此，應采用多個指標綜合評價分析植物的抗寒性，才能得出正確的結論。本研究采用了5個生理生化指標，發現隨著脅迫強度加劇，均體現出明顯的變化規律，研究結果顯示與材料抗寒性有較高的相關性，因此在抗寒性綜合評價時未進行權重分配。另外，研究發現，在模擬低溫脅迫處理時，脅迫方式、梯度、強度對抗寒性的評價結果也有影響，在相關報道中，有直接零下低溫脅迫，有零上低溫脅迫，有設置回溫處理。本研究采用25、15、5、0、-5 ℃的梯度脅迫處理方式，便于觀察植物表型變化與低溫脅迫強度的關系，可與試驗結果相互參比。最終，本研究根據平均隸屬度得出8種禾本科牧草的抗寒性表現為細莖冰草>老芒麥>沙生冰草>蒙古冰草> 多變鵝觀草>冰草>黑藥鵝觀草>大芒鵝觀草。

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