玉米蛋白水解物對大豆油水包油乳狀液物理化學穩定性及體外消化的影響

張文麗　令狐義　李婷　王思齊　孫慧妍　李寒璐　伍娟　程宇

摘要：以D500 nm和TBARS為指標分別考察玉米蛋白水解物對吐溫20-殼聚糖雙層膜O/W乳狀液在4、25、 37 ℃ 下貯藏7 d過程中物理和氧化穩定性的影響。以脂肪酸的釋放量為指標，通過靜態胃-腸消化和動態胃-腸消化體外模擬模型考察玉米蛋白水解物對吐溫20-殼聚糖雙層膜乳狀液脂肪消化的影響。結果表明，盡管玉米蛋白水解物（2.5～10.0 mg/mL）降低了乳狀液的物理穩定性，但是并未降低乳狀液的氧化穩定性。玉米蛋白水解物促進了乳狀液中脂肪的消化，乳狀液中脂肪在動態胃-腸消化模型中的消化速率和程度低于在靜態胃-腸消化模型中。說明玉米蛋白水解物可以改善乳狀液中脂肪的氧化和消化。

關鍵詞：玉米蛋白水解物;乳狀液;穩定性;體外消化

中圖分類號： TS201.7文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0234-05

玉米蛋白由于含有醇溶蛋白和谷蛋白水溶性較差，限制了其在食品工業中的應用。通過酶解制備玉米蛋白水解物是改善玉米蛋白溶解度、提高其在食品工業中應用價值的有效手段。酶水解不僅提高了玉米蛋白的溶解度，還提高了玉米蛋白的生物活性。酶水解得到的玉米蛋白水解物具有抗氧化[1-3]、抑制血管緊張素轉化酶（ACE）活性[4-6]及抑制糖苷酶活性[7]。目前，較多的研究關注玉米蛋白酶解效率提高[8-10]以及活性多肽的制備工藝[6，11-13]，而將玉米蛋白水解物用于改善食品品質的研究則不多。王晶等將玉米蛋白水解物加入到肉糜中，提高了肉糜中脂肪的氧化穩定性[14-16]。石麗梅等將玉米蛋白水解物加入到中式香腸中起到了較好的抗氧化作用[17]?？梢?，玉米蛋白水解物可用于提高食品中脂肪的氧化穩定性。乳狀液是食品中油脂存在的主要形式之一，然而將玉米蛋白水解物用于乳狀液的研究還較少。前期研究表明，將蛋白水解物用于食品乳狀液體系時可以抑制乳狀液脂肪的氧化[18]。同時，Klinkesorn等的研究表明，利用靜電吸附作用制備的小分子乳化劑和殼聚糖組成的多層膜乳狀液不僅可以改善乳狀液的物理化學穩定性，還可以影響乳狀液中脂肪的消化[19-20]。因此，本研究擬考察玉米蛋白水解物對吐溫20和殼聚糖制備的雙層膜乳狀液物理穩定性、氧化穩定性及脂肪消化的影響，為基于乳狀液體系的食品設計和抗氧化肽的應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

玉米醇溶蛋白，購自高郵市日星藥用輔料有限公司，蛋白含量為95%;堿性蛋白酶（Alcalase）2.4 L FG（2.4AU），購自諾維信生物技術有限公司;福臨門大豆油，當地超市購買;胃蛋白酶（pespin，1 200 U/g）、脂肪酶（lipase，3 000 U/g）、豬膽鹽、殼聚糖，均購自上海國藥集團股份有限公司;其他試劑為分析純;試驗用水為純水，自制。

pH計，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;WCR-8 加熱制冷循環器、HG15A高速乳化均質機，購自大韓科學株式會社;TDL-5-A離心機，購自上海安亭科學儀器廠;冷凍干燥機，購自德國Marin Christ公司;AH-basic型高壓均質機，購自ATS工業系統有限公司;UV-2800型紫外可見光分光光度計，購自尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米蛋白水解物的制備

參照Kong等的方法[1]，在50 ℃和pH值為9.0的條件下將玉米蛋白制成30 g/L懸濁液后，用堿性蛋白酶水解4 h，酶底比2%，酶解結束后調pH值至7.0并迅速沸水滅酶10 min，冷卻后離心（20 ℃、5 000 r/min 離心20 min），取上清液冷凍干燥得到玉米蛋白水解物。

1.2.2 乳狀液的制備

稱取一定量吐溫20溶于醋酸緩沖液（100 mmol/L、pH值為3）中制成吐溫20濃度為11.25%水相溶液。將大豆油和吐溫20（1.125%）溶液以一定質量比（10 ∶90）混合后，于20 ℃下用高速分散機在 21 600 r/min 下乳化2 min，再用高壓均質機將乳狀液在 30 MPa 下均質2次，得到乳狀液。在上述乳狀液加入一定量殼聚糖攪拌 30 min 使其充分溶解，制成殼聚糖濃度0.1%的乳狀液。之后稱取一定量的玉米蛋白水解物加入上述乳狀液中攪拌 30 min 使其充分溶解，得到含不同濃度（0、2.5、10.0 mg/mL）玉米蛋白溶解度的乳狀液用于后續研究。乳狀液中加入0.02%山梨酸鉀作為防腐劑。

1.2.3 乳狀液物理穩定性的測定

乳狀液的穩定性用濁度法[21]進行分析。將制備好的乳狀液迅速倒入30 mL小玻璃瓶中，在離瓶底2 cm處取30 L乳狀液于試管中，在試管中加入10 mL SDS溶液1 mg/mL，混勻后測定吸光度D500 nm，用D500 nm表示濁度，在不同溫度（4、25、37 ℃）下測定不同樣品的濁度變化。

1.2.4 乳狀液氧化穩定性的測定

在氧氣充足條件下，將乳狀液分裝在30 mL帶蓋的棕色玻璃瓶中，然后在不同溫度（4、25、37 ℃）下進行氧化，測定儲藏周期（7 d）內乳狀液的丙二醛反應物（TBARS）含量。TBARS含量的測定參考Mei等的方法[22]。以1，1，3，3-四乙氧基丙烷作標準曲線，確定樣品中的TBARS含量。

1.2.5 乳狀液的靜態模型消化

參考Li等的方法[23]，并在此基礎上進行修改。取12 g乳狀液在37 ℃條件下保溫 5 min 后向其加入等質量模擬口腔液[稱取0.159 4 g NaCl、0.020 2 g KCl溶于100 mL磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L、 pH值7.0），調節pH值至6.8]，在37 ℃及磁力攪拌（95 r/min）條件下反應5 min。向反應后的乳狀液加入24 g模擬胃液[稱取0.32 g胃蛋白酶、0.020 g NaCl溶于100 mL磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L、pH值2.5）]，并使其在37 ℃、pH值2.5及磁力攪拌（95 r/min）條件下反應2 h，然后用1 mol/L NaOH溶液調pH值7.0并靜置5 min。向上述乳狀液中加入等量（48 g）模擬小腸液[由4 g膽汁鹽溶液（0.375 g膽鹽和10 mmol/L pH值7.0磷酸鹽緩沖液組成）、2.5 g新制備的脂肪酶懸液（0.134 g脂肪酶和10 mmol/L pH值7.0磷酸鹽緩沖液組成）以及41.5 g 10 mmol/L pH值7.0磷酸鹽緩沖液組成]，后迅速用0.1 mol/L NaOH溶液進行恒pH值滴定，37 ℃磁力攪拌（95 r/min）條件下反應2 h并保持pH值7.0，記錄反應過程中消耗NaOH溶液的體積。

1.2.6 乳狀液的動態模型消化

參考Shani-Levi等的方法[24-25]，并在此基礎上進行修改。在15 g乳狀液中加入 0.5 g pH值2.0的胃液[含有0.43 g胃蛋白酶、0.067 g脂肪酶、0.07 g胃電解液（含4.8 g/L NaCl、12.2 g/L KCl、0.3 g/L CaCl2、1.25 g/L NaHCO3）]后以0.025 mL/min速率分別滴加模擬胃液（5 mL pH值2.0的胃電解液中加入4.3 g胃蛋白酶和0.066 7 g脂肪酶）和胃酸（1 mol/L HCl）120 min，反應結束后操作同“1.2.5”節。

1.2.7 乳狀液中游離脂肪酸釋放量

參考Li等的方法[26]計算消化過程中脂肪酸的脂肪量。游離脂肪酸（FFA）釋放比例計算公式如下：

FFA比例=VNaOH×mNaOH×MLipidwlipid×2×100%。

式中：V為消耗NaOH的體積，L;m為NaOH的摩爾濃度，mol/L;w為消化體系中三?；视偷目傎|量，g;M為三?；视偷钠骄肿淤|量，g/mol，大豆油為876.56 g/mol。

1.3 數據處理與分析

試驗至少進行2次重復（n≥2）。單次重復試驗在不同時間進行，并設置3次平行。試驗數據的差異性通過SPSS 17.0軟件進行方差分析，數據差異性的分析方法為LSD法，顯著差異用P<0.05表示。

2 結果與分析

2.1 玉米蛋白水解物對乳狀液的物理穩定性的影響

研究結果（圖1）表明，不同組成乳狀液在不同儲藏溫度下隨著儲藏時間的增加都呈現濁度下降的趨勢，并且隨著儲藏溫度增加乳狀液濁度下降的程度越大。這是由于乳狀液是熱力學不穩定體系，乳化脂肪顆粒會不斷上浮使容器底部乳化脂肪顆粒的含量下降，而濁度與乳化脂肪顆粒的含量成正相關關系[21]，因而濁度不斷下降。溫度的升高加速了乳化脂肪顆粒的運動速度，導致在37 ℃時濁度下降較快。玉米蛋白水解物濃度在1.0 mg/mL時，乳狀液濁度在儲藏過程中的下降程度要低于未添加玉米蛋白水解物的對照樣品。在貯藏后5 d 時，4、25、37 ℃儲藏條件下對照樣品濁度下降程度分別是添加了1.0 mg/mL玉米蛋白水解物乳狀液的2.13、1.21、1.03 倍，表明玉米蛋白水解物濃度為1.0 mg/mL時，玉米蛋白水解物的加入增加了乳狀液的穩定性。但是當增加玉米蛋

白水解物濃度時，乳狀液濁度下降程度高于對照樣品，表明玉米蛋白水解物濃度在2.5～10.0 mg/mL時其加入導致了乳狀液穩定性下降。

2.2 玉米蛋白水解物對于乳狀液氧化穩定性的影響

試驗結果（圖2）表明，低溫儲藏過程中脂肪氧化較慢，而提高儲藏溫度會顯著提高脂肪氧化的程度，這是因為溫度的升高會提高化學反應的速率。在4 ℃儲藏條件下，對比0 d和7 d不同樣品的氧化穩定性，只有添加了10.0 mg/mL玉米蛋白水解物的乳狀液脂肪氧化產物TBARS的量有顯著提高（P<0.05），貯藏后7 d TBARS的生成量的為貯藏當天的4.41倍。在25 ℃儲藏條件下，對比貯藏當天和貯藏后7 d不同樣品的氧化穩定性，吐溫20制備乳狀液以及添加0、2.5、10.0 mg/mL 玉米蛋白水解物的乳狀液中TBARS的生成量分別提高2.55、6.07、2.31、3.17 倍（P<0.05）。盡管貯藏后 7 d 時吐溫20制備乳狀液與添加不同濃度玉米蛋白水解物的乳狀液中TBARS的生成量沒有顯著差異，但是添加不同濃度玉米蛋白水解物的乳狀液中TBARS的生成量之間有顯著性差異（P<0.05），添加了2.5、10.0 mg/mL玉米蛋白水解物的乳狀液中TBARS的生成量和未添加玉米蛋白水解物乳狀液相比分別降低35.5%、72.8%。在37 ℃儲藏條件下，對比貯藏當天和貯藏后7 d不同樣品的氧化穩定性，吐溫20制備乳狀液以及添加0、2.5、10.0 mg/mL 玉米蛋白水解物的乳狀液中TBARS的生成量分別提高4.39、3.39、2.28、4.50倍（P<0.05）。貯藏后7 d時添加0、2.5、10.0 mg/mL玉米蛋白水解物的乳狀液中TBARS的生成量比吐溫20制備乳狀液分別下降78.6%、51.8%和45.0%（P<0.05）。但是添加0、2.5、10.0 mg/mL玉米蛋白水解物的乳狀液中TBARS的生成量之間并無顯著性差異。以上研究表明，殼聚糖和玉米蛋白水解物加入制備的多層乳狀液的氧化穩定性要高于吐溫20制備的單層膜乳狀液。玉米蛋白水解物的加入并不會降低吐溫20-殼聚糖制備的雙層膜乳狀液的氧化穩定性。

2.3 玉米蛋白水解物對乳狀液脂肪消化程度的影響

2.3.1 乳狀液在靜態胃-腸消化模型中脂肪的消化 靜態模型是體外消化模型中使用得最多的模擬消化模型。不同濃度玉米蛋白水解物對吐溫-殼聚糖雙層膜乳狀液中脂肪消化影響的結果如圖3所示。從圖3可以看出，玉米蛋白水解物的加入增加了乳狀液中脂肪的釋放速率和釋放量，并且脂肪釋放速率和釋放量隨著玉米蛋白水解物濃度的增加而提高。在0～5 min腸消化過程，添加了10.0 mg/mL玉米蛋白水解物的乳狀液中脂肪酸的平均釋放速率是對照樣品的1.71倍。消化結束時，添加了10.0 mg/mL玉米蛋白水解物的乳狀液中脂肪酸的釋放量是對照樣品的1.58倍。表明乳狀液的消化在20 min時基本上就已完成，并且脂肪消化速率隨著時間不斷下降。這是由于脂肪消化產生的脂肪酸自身具有一定表面活性，可以吸附在脂肪表面。同時，腸環境呈中性，消化釋放的脂肪酸會發生皂化生成表面活性比脂肪酸更強的脂肪酸鹽，與膽酸鹽競爭吸附在脂肪表面，從而阻止脂肪酶與底物的作用。

2.3.2 乳狀液在動態胃-腸消化模型中脂肪的消化

盡管靜態模型是常用的消化模型，但是靜態模型未考慮胃消化過程中pH值的變化，而實際人體消化過程中pH值是隨著胃酸的分泌逐漸下降的。因此，本研究引入動態胃消化過程以一定速率動態向乳狀液樣品中添加胃酸來調節pH值變化，結果如圖4所示。從圖4可以看出，和靜態模型pH值恒定在pH值為2不同，乳狀液的pH值隨著胃酸的分泌不斷下降，并且玉米蛋白水解物的加入減緩了pH值下降的速率。添加了 10.0 mg/mL 玉米蛋白水解物的乳狀液在消化進行了 40 min 左右時，pH值才降到pH值2左右。這可能是玉米蛋白水解物及其消化產物與殼聚糖之間通過靜電吸附作用形成一定的緩沖體系，從而消耗了氫離子使水相中游離氫離子濃度升高較慢，pH值下降變緩。

經過胃動態模型消化后的乳狀液進行腸消化階段后脂肪酸的釋放結果如圖5所示。和靜態胃-腸消化時結果相似，玉米蛋白水解物的加入同樣增加了脂肪酸的釋放速率。在 0～5 min腸消化過程，添加了10.0 mg/mL玉米蛋白水解物的乳狀液中脂肪酸的平均釋放速率是未添加玉米蛋白水解物對照樣品的1.41倍，低于靜態胃-腸消化時速率的提高倍數。乳狀液的消化在30 min時基本上完成，時間上也比靜態胃-腸消化時多。對比添加0、2.5、10.0 mg/mL玉米蛋白水解物的乳狀液在動態胃-腸消化和靜態胃-腸消化最終脂肪酸的釋放量，前者分別是后者的86.4%、79.7%、65.4%。這些數據都表明乳狀液在動態胃-腸消化和靜態胃-腸消化模型中有不同的消化結果。

3 討論與結論

根據Mun等的研究結果可知，殼聚糖的加入使乳狀液的表面電位變為正值，從而使乳狀液的穩定性提高[27]。而玉米蛋白水解物在試驗條件下（pH值約為3）所帶電荷為負電，因而玉米蛋白水解物的加入可能會改變乳狀液的表面電位，使乳狀液的物理穩定性發生變化。本研究結果表明，玉米蛋白水解物添加量為1.0 mg/mL時，吐溫20-殼聚糖雙層膜乳狀液的穩定性并不會下降;而提高乳狀液中玉米蛋白水解物濃度到2.5～10.0 mg/mL時，玉米蛋白水解物的加入降低了乳狀液的穩定性。這可能是由于玉米蛋白濃度較高時，靜電吸附作用使殼聚糖表面的部分正電荷被玉米蛋白水解物的負電荷平衡，導致乳狀液表面電位下降，減弱了乳化顆粒間的靜電排斥作用，使小顆粒聚集成大顆粒的概率增加，大顆粒相對小顆粒易于上浮，從而降低了乳狀液的穩定性。

盡管Mun等的研究表明，在吐溫20制備的乳狀液中加入殼聚糖可以提高乳狀液的物理穩定性[27]，但是殼聚糖的加入是否提高了乳狀液的氧化穩定性則未報道。本研究結果表明，殼聚糖的加入可以提高吐溫20為乳化劑制備乳狀液的氧化穩定性，這與Klinkesorn等在卵磷脂制備的乳狀液中加入殼聚糖可以提高乳狀液的氧化穩定性的研究結果[19]一致。殼聚糖在乳狀液表面的正電對金屬離子的排斥作用被認為是殼聚糖提高乳狀液氧化性的機制之一。盡管帶負電玉米蛋白水解物可能會由于靜電吸附作用降低乳狀液表面的正電位，但是玉米蛋白水解物已經被證實有較好的抗氧化活性[1-3]。因此玉米蛋白水解物的加入可能可以通過其自由基清除能力來輔助抑制乳狀液中脂肪的氧化。這使得玉米蛋白水解物的添加不會降低吐溫20-殼聚糖雙層膜乳狀液的氧化穩定性。

乳狀液是食品中脂肪存在的形式之一。由于乳狀液是熱力學不穩定體系，因而穩定性是其重要的性質。而乳化脂肪由于比純油脂體系具有更多的表面積，脂肪更易氧化，因而氧化穩定性也是乳狀液的重要性質，但是這2個性質都是乳狀液的貨架期性質。在食品設計和開發時，在保證貨架期性質的前提下，考慮營養素在體內的釋放而非單純考慮營養素比例，則可以獲得營養品質更好的產品。隨著近年來人們對食品營養品質的關注[28-29]，乳狀液中脂肪進入體內經消化后脂肪酸的釋放受到了研究人員的關注。前面的結果表明，玉米蛋白水解物的加入可以改變吐溫20-殼聚糖雙層膜乳狀液的物理和氧化穩定性，因此本研究接著通過靜態胃-腸消化和動態胃- 腸消化模型對上述乳狀液中脂肪消化進行了分析。玉米蛋白水解物的添加增加了吐溫20-殼聚糖雙層膜乳狀液在消化過程中脂肪酸的釋放量和釋放速率。乳狀液在動態 胃- 腸消化模型中脂肪酸的釋放量和釋放速率低于靜態 胃- 腸消化模型。盡管動態胃-腸消化模型由于有pH值變化過程，消化酶的活性以及體系中各物質之間的作用都在不斷變化，使消化過程更加復雜，但是其更接近實際人體消化的情況，因此應該須要進一步研究。

本研究結果表明，玉米蛋白水解物可以改善食品乳狀液的物理化學穩定性和影響乳狀液中脂肪的消化[30]，顯示了玉米蛋白水解物在改善食品品質中的應用前景。

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