基于蛋白質組學技術的羚羊角的研究與分析

王玉團，石峰，杭寶建，梁翠榮，咸瑞卿，鞏麗萍

山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101

羚羊角為牛科動物賽加羚羊SaigatataricaLinnaeus的角。臨床多以粉末直接入藥，具有平肝息風、清肝明目、散血解毒之功能[1]，特別是治療嬰幼兒高燒能起到立竿見影的效果，并且作用持久、不易反復回升、無毒副作用[2-3]。此外還具有非常好地清肺熱和抗驚厥等藥理作用，故羚羊角在120多種中成藥中廣泛使用。

羚羊角素有“羚羊仙角”的美譽，價格非常昂貴，目前市場上去掉骨塞的一等品每千克售價約20 000元，未去掉骨塞的一等品每千克售價約13 000元。以質嫩、色白光潤如玉、有血絲者為佳(角殼最嫩的角尖部位)。根據上述市場等級規格劃分及性狀描述可知，羚羊角角殼與骨塞價格和藥效具有一定差異，故在《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)1995年版之前的歷版中均規定羚羊角需要用去掉骨塞制成的羚羊角粉才能供臨床使用[4-5]。但鑒于賽加羚羊已被列入中國一級保護野生動物名錄、瀕危野生動植物物種國際貿易公約(CITES)附錄II、遷徙物種公約(CMS)附錄II以及IUCN紅色名錄中極危物種行列，為保護野生賽加羚羊，合理利用羚羊角的骨塞(質量約占整支羚羊角的40%)，《中國藥典》在1995年版之后規定不再去掉骨塞，骨塞也全部等同角殼一并入藥，但因兩者價格差異巨大(骨塞價格僅為角殼的1%左右)，且現行標準中沒有定量檢驗項目，故市場上銷售的羚羊角粉大量使用骨塞來代替角殼，以降低生產成本。該現象在中成藥中更加突出，嚴重影響了含羚羊角制劑的臨床療效。羚羊角角殼的主要成分為角蛋白質，骨塞的主要成分為磷酸鈣，同時也含有少量角蛋白質和骨膠蛋白質等，雖然文獻報道角殼和骨塞都具有明顯的解熱作用，但解熱作用效果角殼約是骨塞的3倍[6]。鑒于兩者所含成分和價格差異非常明顯，考慮到骨塞所含的磷酸鈣為其骨架支撐部分，與羚羊角功能聯系較弱，故認為可能是角殼所含的角蛋白質和骨塞所含的骨膠蛋白質及角蛋白質與羚羊角的功能關系密切，故非常有必要對角殼和骨塞所含的蛋白質成分進行深入研究，以合理地使用羚羊角。

目前對羚羊角成分研究主要集中在氨基酸和微量元素的組成與差異兩個方面[7-10]，也有基因方面的研究報道，而羚羊角的主要功能成分角蛋白還沒有進行過深入研究，對動物類中藥材進行研究分析，目前非常有效的方法是通過蛋白質組學技術進行研究，將羚羊角樣品進行適當酶解處理，通過Nano-LC-Orbitrap液質聯用儀進行多肽分離及質譜數據采集，結合UniPortKB收錄的Capra Hircus蛋白質組數據庫，采用PEAKS Studio軟件進行多肽和蛋白質序列的鑒定。

1 儀器與材料

1.1 儀器

EASY-nLC 1000納升液相聯用Fusion-Orbitrap高分辨質譜(Thermo Scientific公司)；ReproSil-Pur C18-AQ Trap富集柱(0.2 mm×3.5 cm，5 μm)和ReproSil-Pur C18-AQ分離柱(75 μm×25 cm，3 μm)為實驗室自制。

1.2 材料

Millipore-10 K超濾管；胰蛋白酶(Sigma公司，批號：SLBG6452V)；羚羊角對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，全部為角殼部分，批號：1064-0801)；羚羊角骨塞(本單位標本館留存樣品，經山東中醫藥大學彭艷麗主任藥師鑒定為SaigatataricaLinnaeus角的骨塞)；鹽酸胍、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、碳酸氫銨、乙酸均為分析純；甲酸、乙腈為質譜純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取羚羊角對照藥材10 mg，骨塞粉末30 mg，分別加10 mL變性緩沖液(含6 mol·L-1鹽酸胍、1.2 mol·L-1Tris和2.5 mmol·L-1EDTA二鈉)，加0.5 mL的0.5 mol·L-1DTT溶液，置于60 ℃保溫處理12 h，取出，放冷至室溫。加入1.2 ml的0.55 mol·L-1IAA溶液，搖勻，避光反應30 min。離心，取上清液50 μL置于超濾管中，離心脫鹽，截留物加200 μL的1%碳酸氫銨溶液和5 μL胰蛋白酶溶液(10 mg·mL-1)，置于37 ℃恒溫培養箱中酶解12 h，0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.2 納升液相色譜條件

色譜柱為上述自制的富集柱和分離柱。流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1，進樣量為1 μL，流速300 nL·min-1。

表1 納升液相色譜梯度洗脫程序

2.3 高分辨質譜條件

采用Fusion-Orbitrap高分辨質譜儀，Nanospray Flex離子源，以正離子模式進行采集，噴霧電壓為2.1 kV，離子傳輸毛細管溫度為277 ℃，S-Lens傳輸效率設置為60%。一級質譜采用Orbitrap作為質量分析器，分辨率為60 000(m/z400)，采集范圍為350～1550 Th；二級質譜采用離子阱作為質量分析器，采用Rapid Scan模式進行掃描，采用HCD碎裂模式，碎裂能量NCE設置為40%。

2.4 數據采集

本方法分析時間為70 min，采集的總離子流圖見圖1。

注：A.角殼；B.骨塞。圖1 Fusion-Orbitrap采集的羚羊角總離子流圖

2.5 數據處理方法

因目前沒有賽加羚羊完整的蛋白質組數據庫，故選擇與其親緣關系較近的Capra Hircus(山羊)蛋白質組數據庫進行比對。利用蛋白質解析軟件PEAKS Studio 8.5采用UniPortKB收錄的Capra Hircus(截至2018年1月1日)作為參考蛋白質組數據來處理質譜數據。為了得出更有效的數據進行下一步分析，必須進行參數的合理設置。其中相應的軟件參數設置如下：-10 lgP(Peptide)≥20、-10 lgP(Protein)≥20、FDR(Peptide-Spectrum Matches)=0.1%、FDR(Peptide Sequences)=0.1%、Ascore(Post-translational modification of Peptide)≥0、Peptide mutation ion intensity≥0%、Proteins unique peptides≥0、ALC(De novo only)≥50%、Protein Coverage(Top10)。-10 lgP為質量值，表示被測錯的概率，-10 lgP值越大，被測錯的概率越大，-10 lgP≥20代表被測錯的概率不大于1%。FDR為容錯率False discovery rate，是指在某個體系中能減少一些因素或選擇對某個系統產生不穩定的概率。FDR值越低，對效果影響越大，結果越集中。設定無論氨基酸修飾還是變異大小全部進行檢測，并對覆蓋度前10的蛋白質進行排序。

表2 多肽檢測結果

3 分析

3.1 總離子流圖分析

由圖1可知，角殼和骨塞酶解后多肽的總離子流色譜圖具有一定的相似性，特別是在約15、30、37、44、52、56 min處均具有很高色譜峰出現，主要的色譜峰保持較高的一致性。同時在約26、32、50、65 min處兩者總離子流圖又具有明顯的不同，可以很好地將兩者進行區別。特別是50 min處兩者具有明顯的不同，骨塞比角殼多出一個色譜峰，提示兩者多肽組成具有某些差異。綜上，角殼和骨塞的多肽組成具有一定的相似性，也存在某些差異。

表3 覆蓋度前10的蛋白質組成

注：共有的蛋白質用正體標示，差異性蛋白質用斜體標示。

3.2 多肽檢測種類及差異性分析

根據表2結果可知，角殼中多肽種類更加豐富，比骨塞多出約300種，說明角殼具有更多的多肽及蛋白質種類和數量。角殼和骨塞兩者共有的多肽數近400種，共有多肽種類所占總多肽種類數分別為28%和35%，說明兩者的多肽組成具有一定的相似性，同時也說明兩者的多肽和蛋白質組成也存在明顯差異，該分析結果與總離子流圖分析結果具有相關性。

3.3 覆蓋度TOP 10 蛋白組成的分析

將蛋白質分子選用特異性胰蛋白酶進行切割，酶解后的供試品為復雜的肽段組成的混合物，然后經過液相聯用質譜儀進行檢測，將檢測信號轉換成肽段信息，再通過與數據庫中蛋白質進行結構比對，進而計算得到覆蓋度。基于蛋白質覆蓋度的高低可以預測目標物中蛋白質的組成。角殼中前10的蛋白覆蓋度在81%～99%，覆蓋度均較高；骨塞中前10的蛋白覆蓋度在56%～73%，覆蓋度較低，最低者接近50%，故試驗中選擇了覆蓋度前10的蛋白進行比較分析。角殼中覆蓋度前10的蛋白質全部為角蛋白質，而骨塞中覆蓋度前10的蛋白質有80%是角蛋白質和20%是骨膠蛋白質，提示角殼和骨塞蛋白質組成存在明顯差異。同時兩者覆蓋度前10的蛋白質有8個是相同的，說明兩者的主要蛋白質存在較高的相似性。角殼中蛋白質覆蓋度較高，提示角殼中所含蛋白質在結構上與對應的蛋白質最為相近。

4 討論

完整的羚羊角包括外層的角殼和內部的骨塞兩部分，基于蛋白質組學技術對兩部分進行了深入研究，比較分析兩者多肽及蛋白質組成差異，發現兩者多肽和蛋白質在數量及種類上都存在明顯差異，但也有相當高的相似性。研究表明骨塞在一定條件下可以替代角殼使用，不去掉骨塞的羚羊角直接磨成粉使用具有一定的合理性，可以擴大藥源，充分利用骨塞部分，可更好地保護野生動物，但也必須控制好骨塞的用量比例，畢竟兩者多肽種類方面也存在明顯差異。現行《中國藥典》中羚羊角粉無任何質控項目，應進一步提高《中國藥典》中羚羊角粉的質量控制水平，將角殼和骨塞的用量比例控制在合理范圍內，確保羚羊角臨床用藥的安全性和有效性。本研究尚未對角殼和骨塞的主要蛋白質和多肽進行定量研究，應進一步探究角蛋白的量效關系，為羚羊角的合理利用提供更多的技術支持。