2008-2018年北京市傷寒、副傷寒沙門菌病原學特征

曲梅 黃瑛 張新 呂冰 賈蕾 田祎 王全意

傷寒、副傷寒是由傷寒和副傷寒(甲、乙、丙血清型)沙門菌引起，經糞口途徑傳播，常引起急性腸道傳染病的暴發，屬于乙類傳染病，一直是北京市重點監控的傳染病之一。隨著衛生環境的改善及綜合防治措施的落實，北京市傷寒、副傷寒的發病得到有效控制，維持在較低水平，但仍有散發病例持續存在[1,2]。近年來，在抗生素的選擇壓力下，沙門菌耐藥現象日趨嚴重[3]。為更好地開展監測和防控工作，了解傷寒、副傷寒菌型變遷和流行特征，現將北京市2008-2018年傷寒、副傷寒沙門菌臨床分離株進行血清型、耐藥性和分子分型分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 2008-2018年，北京市腸道門診監測系統采集的腹瀉患者標本，經各區疾控中心進行分離培養，初步鑒定為傷寒、副傷寒沙門菌的散發臨床分離株56株，及一起輸入性傷寒暴發疫情的9株菌，共計65株。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定： 傷寒、副傷寒沙門菌的分離培養參照衛生部行業標準WS280-2008附錄A進行。將各區上送的可疑傷寒、副傷寒沙門菌轉種于營養瓊脂培養基上過夜培養，采用法國梅里埃公司VITEK2-Compact全自動微生物鑒定系統進行系統生化鑒定。

1.2.2血清分型試驗： 針對沙門菌群(A～F)多價血清、菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原和Vi抗原進行血清凝集試驗。方法為挑取三糖斜面上少量菌苔與A～F多價抗血清在室溫下進行玻片凝集，1 min 內出現凝集顆粒為陽性；按同樣方法與O單價抗血清進行逐一凝集來確定O抗原，根據確定的O抗原進行相應的H多價和單價血清凝集以確定最終血清型。玻片凝集時需設生理鹽水對照。沙門菌診斷血清為丹麥SSI血清研究所產品，均在有效期內使用。

1.2.3藥敏試驗： 采用最小抑菌濃度(minimal inhibition concentration，MIC)法，使用上海星佰生物技術有限公司生產的革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板，藥物應用環丙沙星(CIP)、鏈霉素(STR)、氨芐西林(AMP)、氯霉素(CHL)、磺胺異噁唑(SUL)、復方新諾明(SXT)、萘啶酸(NAL)、阿莫西林-克拉維酸(AUG)、頭孢曲松(CRO)、強力霉素(DOX)、慶大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZM)、四環素(TET)、頭孢西丁(FOX)、頭孢吡肟(FEP)以及亞胺培南(IMP)16種藥物進行沙門菌耐藥性檢測，其結果與美國臨床實驗室標準化協會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)2016年標準比較，以大腸埃希菌(ATCC25922)做為質控菌株。對三種及以上抗生素耐藥，既為多重耐藥(multidrug resistance, MDR)。

1.2.4脈沖場凝膠電泳(PFGE)： 參照PulseNet制定的沙門菌脈沖場電泳標準分型方法。沙門菌標準株H9812做為分子量標記。內切酶 XbaI(40 U)，37 ℃酶切3 h。電泳條件：電壓6 v/cm，脈沖時間從2.2～63.8 s，線性轉換，轉換角度120°，電泳時間19 h，電泳溫度14 ℃。脈沖場凝膠電泳儀為Bio-Rad，CHEF III；凝膠成像系統為Bio-Rad Gel-DOCXR。內切酶購自New England公司。采用國家致病菌識別網信息化平臺系統對電泳圖像進行處理、網絡化數據傳輸和比對分析。聚類樹狀圖根據非加權配對算術平均法(unweighted pair-group method using arithmetic averages，UPGMA) 構建。

1.3統計學方法 采用SPSS 19.0軟件和WPS 2016專用版對數據進行頻數和百分構成分析。

2 結果

2.1血清分型及年齡組情況 2008-2018年，傷寒、副傷寒沙門菌株共65株，分布于北京市16個區。男女比例1.2∶1(35/30)，以男性居多。其中，傷寒沙門菌24株，占36.9%，主要分布于2008、2010、2013和2015-2017年，平均每年2～5株，2018年，有一起輸入性傷寒暴發分離到9株菌。甲型副傷寒沙門菌7株，占10.8%，主要分布在2013-2015和2017年；乙型副傷寒沙門菌20株，占30.8%，主要分布在2009-2011和2013-2016和2018年；丙型副傷寒沙門菌14株，占21.5%，主要集中在2009-2012年。年齡分布0～10歲組和31～40歲組最多，均占24.6%，其次是41～50歲組和21～30歲組，分別占18.5%和13.8%，11～20歲組最少占4.6%(表1)。

2.2藥敏試驗結果 65株傷寒、副傷寒沙門菌對16種抗生素的敏感和耐藥程度不同(表2)。傷寒沙門菌對萘啶酸的耐藥率最高為20.8%，其次為鏈霉素和磺胺異噁唑，而對頭孢類抗生素、阿莫西林-克拉維酸、強力霉素，阿奇霉素和亞胺培南等均100%敏感。甲型副傷寒沙門菌對氟喹諾酮類抗生素萘啶酸和環丙沙星的耐藥率分別為100.0%和57.1%，對氯霉素和磺胺異噁唑的耐藥率均為14.3%，對其他抗生素均敏感。乙型和丙型副傷寒沙門菌對磺胺異噁唑的耐藥率分別為20.0%和35.7%，對其它抗生素的耐藥率均低于10%。臨床上治療腹瀉常用的頭孢菌素、環丙沙星(除甲型副傷寒外)，以及氨基糖甙類慶大霉素對4種血清型沙門菌普遍較敏感，敏感率均>75%。多重耐藥分析顯示，甲型副傷寒的多重耐藥最明顯，耐藥率達到28.6%，存在對8種抗生素的聯合耐藥。傷寒沙門菌多重耐藥率最低，為4.2%。

表1 傷寒、副傷寒沙門菌株不同年齡組、性別及血清型分布

表2 2008-2018年傷寒、副傷寒沙門菌耐藥情況

2.3PFGE分子分型 用限制性內切酶XbaI 將傷寒、乙型副傷寒和丙型副傷寒沙門菌共58株菌，全基因組酶切后，每株菌產生12～20條電泳條帶，各片段分子量為20～700 kb。各菌株圖譜間DNA條帶數量和位置完全相同為同一型別，若有1條或1條以上的條帶差別，即判為不同的型別。58株菌分為34種帶型(Sal.BJ001～Sal.BJ034)，經聚類分析，總體相似系數在32.2%～100%，帶型分散，無明顯優勢型別(圖1)。其中2018年的9株傷寒沙門菌帶型一樣Sal.BJ0032，為一起輸入性暴發，占15.6%，但與其它型別存在明顯差異,有5種型別分別包含3株菌，各占5.2%,6種型別分別包含2株菌，各占3.4%。雖然這些菌株克隆來源一樣，但病例均來自不同的區，不同的年份，沒有流行病學上的關聯。其余22種帶型都只有1株菌。

3 討論

3.1全球范圍傷寒或副傷寒流行與菌株的優勢血清型有關，存在變遷替換現象[4]。此次分析發現,2008-2018年，北京市腸道門診監測系統腹瀉患者糞便標本中傷寒、副傷寒沙門菌維持在較低水平。2008-2012年，傷寒沙門菌和乙型、丙型副傷寒沙門菌均有流行或交替出現，但2013年以后，則主要以傷寒沙門菌和乙型副傷寒為主，偶有甲型副傷寒的散在菌株。據文獻報道，甲型副傷寒多是在沿海地區、西南部省份和東部省份高發，江西、浙江、廣西、云南等地多次出現暴發疫情，并在長時間持續擴散[5]。此次研究結果顯示，65株傷寒副傷寒沙門菌以0～10歲組和31～40歲年齡組居多，與文獻報道一致[1,3]。世界衛生組織一直認為5～15歲組是傷寒、副傷寒的高發年齡組[4]，這與低齡段兒童，免疫系統發育不完善，自身抵抗力較弱，容易受細菌和病毒的侵犯有關[6,7]。傷寒、副傷寒散發病例的主要傳播途徑為污染的食物(特別是海產品)。青壯年作為社會的主要生產力，外出工作就餐的機會多，故接觸病原體的機會較多，易患病。總之，應加強對低齡兒童和重點人群的監測和防控，加強食品安全和公共衛生監管、保護易感人群、防止病從口入。

圖1 58侏傷寒、副傷寒沙門菌PFGE聚類分析圖

3.2PFGE是公認的細菌分子流行病研究的“金標準”，其優勢是直接針對整個細菌染色體DNA進行分析，分辨能力強、實驗結果穩定、重復性好[8]。北京市傷寒、副傷寒沙門菌的PFGE型別較多且分散，表明患者間菌株的遺傳親緣關系相對較遠，流行病學表現為高度散發，無聚集性。近10年來，北京市確實沒有傷寒或副傷寒的暴發疫情[1]。但在2018年夏天，通過北京市腸道門診病例監測，發現某區環建公司工人集體去外地勞務支援，時隔一個月后回京陸續發病，引起傷寒輸入性暴發，共分離到9株傷寒沙門菌，經PFGE圖譜分析發現，該起暴發為同一克隆來源。隨即展開流調和異地協查，由于是京外感染，空間的阻隔和時間的滯后，很遺憾最終沒能追溯到感染來源，但這提出了警示：目前傷寒、副傷寒病例癥狀越來越不典型，發病周期和潛伏期長、易復發，且存在慢性帶菌。雖然流行方式多呈散發，但城市化和全球化對公共衛生的影響越來越大，北京流動人口數量巨大，人口流動會帶來傳染源輸入風險，而且這種風險會持續存在，隨時都有暴發的可能，因而要引起廣泛關注。

3.3與既往本地區的研究數據相比[9]，傷寒、副傷寒沙門菌對磺胺異噁唑、萘啶酸、鏈霉素和氨芐西林等經典抗生素耐藥率在增加。雖然不同血清型對各種抗生素的耐藥率有明顯差異，但總體上對阿莫西林克拉維酸、強力霉素、阿奇霉素和亞胺培南所有菌株均敏感。甲型副傷寒沙門菌的耐藥率高于傷寒沙門菌和其它兩型，這與浙江等地的研究結果一致[10]。值得關注的是，本研究顯示甲型副傷寒沙門菌對第1代喹諾酮類藥物萘啶酸100%耐藥，而氟喹諾類藥物環丙沙星的耐藥率已上升為57.1%，敏感率只有14.3%，且患者年齡<18歲禁用喹諾酮類藥物，臨床用藥應引起足夠重視。臨床上兒科常用藥大環內酯類的阿奇霉素和第3、4代頭孢菌素對各種血清型敏感率都很高，應該是治療傷寒、副傷寒沙門菌感染的首選藥。該地區傷寒、副傷寒菌株耐藥率的逐步增高和多重耐藥株的出現讓人憂慮。抗生素的濫用及不規范使用是導致細菌耐藥的一個重要因素，臨床上在治療時，必須了解目前流行的血清型和耐藥模式，有針對性的合理選用抗生素，以確保其安全性和療效。因此，要持續、系統地開展傷寒、副傷寒病原學和耐藥監測，以了解該地區沙門菌流行血清型及其相應的耐藥性變化規律，為臨床治療提供數據支持。