小麥丙氨酸-乙醛酸轉氨酶基因( TaAGT2)的克隆、 生物信息學預測及表達分析

吳 凡，徐德芳，宋少帥，李超卿，穆 平

(1.青島農業大學農學院，山東青島 266109； 2.東營市農業科學院，山東東營 257091)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國干旱半干旱地區種植的主要農作物。干旱會影響小麥的生長發育，限制其產量的提高[1]。在植物生長發育過程中經常受到惡劣環境的影響，如干旱、鹽漬、低溫等，其中干旱是各種非生物脅迫中對植物損害最嚴重的因素，直接影響植物的生長及產量。植物在長期進化的過程中，形成了復雜的脅迫響應機制，以適應干旱環境。這種機制不僅包括形態結構如葉片和根系的變化調節[2]；生理和生化水平的調節，如植物的光合作用、光呼吸、氮代謝、滲透調節和抗氧化系統的調節等；還有分子水平的調控，如抗旱基因的表達、逆境相關蛋白的合成等[3-4]。

研究表明，光呼吸是光合作用的補充反應，可以消耗體內的乙醛酸，減少其對細胞的傷害，是植物生長發育過程中為抵御不良環境、提高抗逆性等形成的一種反應途徑[5]。在植物進行光呼吸代謝時，乙醛酸會在轉氨酶(甘氨酸-乙醛酸轉氨酶)的催化作用下生成甘氨酸[6]，甘氨酸進入線粒體后在轉氨酶的作用下生成絲氨酸，過量的絲氨酸會循環進入過氧化物酶體，在絲氨酸-乙醛酸氨基轉移酶(SGAT)的作用下，進入葉綠體中參與卡爾文循環，由此可見植物光呼吸的過程離不開轉氨酶(aminotransferase，transaminase)的催化作用。轉氨酶是存在于生物體內的催化劑，在氨基酸的代謝中起到重要作用，在不同的氨基酸供體和中間物存在的條件下，催化氨基酸與酮酸之間的氨基轉移，生成一種新的氨基酸，從而實現催化氨基酸的合成和降解的作用， 其反應是可逆的[7]。植物絲氨酸-乙醛酸氨基轉移酶(SGAT)與谷氨酸-乙醛酸氨基轉移酶(GGAT)主要催化乙醛酸的轉氨反應,是光呼吸途徑中的兩種關鍵酶。此外，甘氨酸-乙醛酸轉氨酶可以催化丙氨酸-乙醛酸反應、絲氨酸-乙醛酸轉氨反應以及絲氨酸-丙酮酸鹽代謝過程[8]，在植物光呼吸過程中也發揮著重要作用。

本研究基于抗旱小麥品種青麥6號的轉錄組數據，通過生物信息學分析所得差異表達基因，篩選與轉氨酶有關的差異表達基因，從中發現一種轉氨酶——丙氨酸-乙醛酸轉氨酶(alanine-glyoxylate aminotransferase，AGT)，通過查閱大量文獻，發現在人和動物中均報道過丙氨酸-乙醛酸轉氨酶，而植物中的丙氨酸-乙醛酸轉氨酶未見報道。由于丙氨酸-乙醛酸轉氨酶是一種轉氨酶，所以推測其可能參與植物光呼吸的某個過程。為了進一步探索編碼丙氨酸-乙醛酸轉氨酶基因的功能，本研究通過RACE技術獲得小麥中一個編碼丙氨酸-乙醛酸轉氨酶的基因序列，將其命名為TaAGT2，并對其進行生物信息學分析及表達分析，以期為后續基因功能研究和分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以小麥品種青麥6號為試驗材料。挑選大小一致、飽滿的青麥6號種子200粒，用75%的乙醇消毒1 min，置于鋪有兩層濾紙的發芽盒中，在光照培養箱(25 ℃/15 ℃；16 h光照，8 h黑暗；250 μmol·m-2·s-1)內培養,種子萌發7 d左右，將幼苗轉置于盛放Hoagland營養液的培養盒，每3天換1次營養液。當幼苗長至兩葉一心時，選擇長勢一致的植株分別進行低溫(4 ℃)、脫落酸(100 μmol·L-1ABA)、干旱(20% PEG)和高鹽(200 mmol·L-1NaCl)處理，每個處理3次重復。分別在不同脅迫處理的0、3、6、12、24、48和72 h采集幼苗，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

總RNA提取按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(賽恩斯,中國山東)說明書進行[9]。提取后的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性；用紫外分光光度計在波長260 nm和280 nm處測吸光值，檢測RNA的純度。將純度高且完整性好的RNA,按照SMARTerRACE 5′/3′Kit(賽恩斯，中國山東)說明書合成3′RACE-Ready cDNA。將符合質量要求的RNA,按照HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(諾唯贊，中國南京)說明書合成cDNA用于后續實時熒光定量PCR。

1.3 TaAGT2基因的克隆

1.3.1TaAGT2基因的3′RACE擴增

根據從轉錄組數據中找到的編碼丙氨酸-乙醛酸轉氨酶基因的不完整序列，用 Primer Premier 5.0 軟件設計3′RACE 的特異性引物和巢式 PCR 反應的特異性引物。利用特異性引物OUTAGT2、通用引物 UPM 和 3′RACE -Ready cDNA進行第一步 PCR 反應,反應體系與程序參考說明書。將第一步 PCR 產物稀釋 50 倍,進行巢式PCR 反應，所用引物為INAGT2[10]。將擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切膠回收后,與pEAST-T1載體連接，轉化至大腸桿菌感受態DH5α(諾唯贊，中國南京)，挑取單克隆，經菌液PCR鑒定正確后，送由青島擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.3.2TaAGT2基因的全長克隆

為獲得TaAGT2基因的開放閱讀框，設計特異性引物AGT2-F和AGT2-R(表1)，利用高保真酶2×PhantaMax Master Mix(諾唯贊，中國南京)進行PCR擴增。反應體系與程序參考說明書，其中循環數為35，退火溫度為62 ℃，延伸時間為1.5 min 。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，克隆載體的構建與轉化，經鑒定后測序，具體參照1.3.1。

1.4 TaAGT2基因編碼蛋白的生物信息學分析

利用NCBI-ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對測序結果進行蛋白編碼框預測，并將其翻譯成氨基酸序列。通過NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白質的保守結構域。利用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進行蛋白質的基本理化性質分析，包括TaAGT2基因編碼蛋白的分子式、分子量、理論pI值及氨基酸組成等；用CBS-TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0/)和CBS-Signal P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白質的跨膜區結構和信號肽；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和ExPASy-SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)預測及分析蛋白質的二、三級結構。用在線分析工具Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進行蛋白質的亞細胞定位。用DNAMAN 對蛋白質序列進行多序列分析。用MEGA6.0軟件生成NJ系統進化樹。

1.5 實時熒光定量PCR檢測 TaAGT2的表達

以小麥不同脅迫處理的cDNA為模板，以β-actin作為內參基因，用特異性引物TaAGT2-F和TaAGT2-R(表1)，在CFX96型實時熒光定量PCR儀上進行定量分析。qRT-PCR體系和程序按照ChamQTMSYBRColor qPCR Master Mix(諾唯贊,中國南京)說明書進行，每個樣品重復3次，目的基因的相對表達量用2-△△Ct法計算[11]。通過SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 TaAGT2基因的克隆結果

以3′RACE-Ready cDNA為模板，通過引物OUTAGT2、INAGT2和3′UPM引物進行擴增，得到基因的3′序列，與轉錄組測序所得序列拼接得到基因TaAGT2全長cDNA序列，再通過特異性引物AGT2 F和AGT2 R進行PCR擴增,擴增產物如圖1。切膠回收后，與pEAST-T1載體連接，轉化至大腸桿菌感受態DH5α(諾唯贊，中國南京)，挑取單克隆，經菌液PCR鑒定正確后送由公司測序。經NCBI ORF Finder分析，所得序列的ORF長1 434 bp，編碼477個氨基酸。

表1 本研究所用引物的基本信息Table 1 Primers used in this study

2.2 TaAGT2基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1 TaAGT2蛋白的理化性質

ExPASy-ProtParam在線預測蛋白質的基本理化性質，結果顯示，TaAGT2蛋白的分子式為C2288H3601N633O665S18，分子量為51.2 kDa，理論等電點(pI)8.13，為堿性蛋白。其氨基酸組成如表2，含量最高的氨基酸是丙氨酸 (12.2%)，含量最低的是色氨酸(0.4%)。帶負電的殘基總數(Asp + Glu)47個，帶正電的殘基總數(Arg + Lys)為49個。該蛋白的理論半衰期為30 h，不穩定系數為28.46，為穩定型蛋白，脂肪系數為86.98，平均親水性為 -0.053，表明該蛋白總體上親水性和疏水性接近平衡。

M：DL2000 DNA Marker；1：AGT2 F/AGT2 R的擴增產物。

M: DL2000 DNA Marker; 1: Amplified products of primer AGT2 F/AGT2 R.

圖1TaAGT2基因的PCR產物電泳圖

Fig.1 Electropherogram of PCR product of geneTaAGT2

表2 TaAGT2蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of TaAGT2 protein

2.2.2TaAGT2基因編碼蛋白的亞細胞定位、跨膜區和信號肽及結構

通過Cell-PLoc 2.0在線軟件對TaAGT2蛋白亞細胞定位預測顯示：TaAGT2蛋白定位于線粒體。CBS-TMHMM和CBS-SignalP 在線預測表明，該蛋白無任何跨膜區域，且不存在信號肽，由此推測TaAGT2不是分泌蛋白。保守結構域分析結果表明，TaAGT2 蛋白中含有保守結構域 OAT。此結構域為AAT- I超家族所共有，推測該蛋白是 AAT- I 家族成員。用SOPMA在線工具對AGT2蛋白二級結構的預測結果表明，該蛋白包括42.14%的α螺旋(Alpha helix )、16.98%的延伸鏈(extended strand)、7.97%的β轉角(Beta turn)和32.91%的無規則卷曲(random coil)。用ExPASy-SWISS-MODEL對蛋白進行三維結構預測，結果顯示，該蛋白的三級結構多為α螺旋和無規則卷曲。

2.2.3 TaAGT2 蛋白質的同源性及系統進化樹構建

將TaAGT2基因編碼的氨基酸序列在NCBI-BlastP蛋白質數據庫中進行多序列比對，發現其與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon： XP_003568249.1)、水稻(Oryzasativa：XP_015639493.1)、高粱(Sorghumbicolor：XP_002441258.1)、谷子(Setariaitalica：XP_004961760.1)、節節麥(Aegilopstauschiisubsp：XP_020198627.1 )、玉米(Zeamays：PWZ16817.1)等禾本科植物的氨基酸序列相似性在80%～94%之間，表明TaAGT2蛋白在禾本科植物中具有較強的保守性(圖2)。利用MEGA6.0對以上氨基酸序列構建NJ系統進化樹，由圖3可知，TaAGT2蛋白與小麥近緣物種節節麥的AGT基因及二穗短柄草的AGT基因位于同一進化分支，親緣關系較近，可能具有相同的起源。

圖2 TaAGT2蛋白的氨基酸序列比對分析Fig.2 Alignment analysis of TaAGT2 amino acid sequence

圖3 TaAGT2蛋白與一些禾本科及其他植物AGT2氨基酸序列的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TaAGT2 protein and some AGT2 amino acid sequences of gramineae and other plants

2.3 TaAGT2基因的表達特性分析

從圖4可以看出，基因TaAGT2在小麥根、莖和葉中均有表達,但在不同組織中的表達有差異，在莖中的表達量最高，顯著高于根和葉，推測基因TaAGT2主要在莖中表達。

從圖5可以看出，在4種非生物脅迫條件下，小麥幼苗中基因TaAGT的表達均發生了明顯的變化。在4 ℃低溫脅迫下，TaAGT2的表達量隨著脅迫時間的延長而升高，72 h時表達量最大，為對照的44.02倍。ABA脅迫下，處理3 h時達到最高點，為對照的6.8倍，6～12 h有所下降，24 h再次上升，48～72 h又出現下降，但TaAGT2的相對表達量總體上均高于對照。干旱脅迫6 h，TaAGT2表達量為對照的2.24倍， 12～24 h有所下降，48 h的表達量有所回升，72 h再次下降。在鹽脅迫3 h時，TaAGT2達到對照的5.2倍，在隨后的脅迫時間內表達量下降。以上結果表明，基因TaAGT2參與了4種非生物脅迫的應答反應，是作用廣泛的脅迫應答基因，而不是在某種脅迫條件下特異表達的基因。干旱、低溫、ABA和高鹽這4種非生物脅迫的信號轉導途徑之間有一定的聯系，同時也表明植物對非生物脅迫的應答反應受復雜的信號網絡調控。

3 討 論

隨著分子生物學的發展，轉錄組學、蛋白質組學和基因組學成為探索和研究生物奧秘的主要手段，其中最受研究者歡迎的就是轉錄組學[12]。轉錄組學中的轉錄組測序技術(RNA-seq)是一種高通量、高準確性、高效率和低成本的測序技術。轉錄組即一個活細胞所能轉錄出來的所有RNA的總和，是研究細胞表型和功能的一個重要手段，也是挖掘一些與重要生理功能相關基因，揭示基因表達和調控規律的有效方法[13]。本研究就是基于轉錄組測序技術，通過GO和KEGG分析差異顯著基因，從中篩選出了一系列與轉氨酶有關的基因，最終以編碼丙氨酸-乙醛酸轉氨酶的基因作為候選基因，進行基因克隆及生物信息學分析，為進一步驗證候選基因的功能奠定了基礎。

圖柱上字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

Different letters above the columns indicate significant difference(P<0.05).

圖4TaAGT2在小麥不同組織間的差異表達

Fig.4Differential expression ofTaAGT2in different tissues of wheat

圖柱上字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

Different letters above the columns indicate significant difference(P<0.05).

圖5TaAGT2基因在不同脅迫處理下的表達差異

Fig.5 Differential expression ofTaAGT2gene under different stress treatments

cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends，RACE)由Frohman等[14]于1988年首次提出，是一種基于PCR從低豐度的轉錄本中快速擴增cDNA的5′和3′末端的有效方法，以其簡單、快速、廉價等優勢而受到越來越多的重視。另外，由于RACE的敏感性高，特別適合于對低拷貝數基因的獲得，因此，成為克隆未知基因全長cDNA序列的常用手段。隨著現代生物技術及分子生物學的發展，使人們對植物抗逆的分子機理有了進一步的認識。利用生物信息學分析，可以從測序數據中預測可能的抗性基因，從而指導人們發現和鑒定這些基因。本研究通過RACE技術從小麥中克隆了丙氨酸乙醛酸轉氨酶(TaAGT2),該基因具有完整的開放閱讀框，多序列比對及系統進化樹分析其與多種植物的丙氨酸乙醛酸轉氨酶相似，被預測定位于線粒體中，可能與光呼吸中的乙醛酸代謝途徑有關，乙醛酸氨基轉移酶是光呼吸途徑中催化乙醛酸生成甘氨酸的轉氨酶，因此推測TaAGT2基因編碼的蛋白可能參與了光呼吸途徑。

光呼吸是植物體內重要的代謝過程，越來越多的研究表明，光呼吸途徑可以提高植物的抗逆性和抗病性[15-17]，可能是由于編碼光呼吸途徑中關鍵酶的基因，參與了植物對生物及非生物脅迫下的應答反應，但具體的調控機制還需要深入探究。如大豆中編碼絲氨酸/丙氨酸-乙醛酸轉氨酶基因(GmSAGT1)的表達與大豆霜霉病抗性密切相關[18]。干旱脅迫下植物中與光合作用相關的酶活性下降，而與光呼吸相關的酶如煙草中的乙醛酸轉氨酶的活性不受影響，甚至有的酶活性上升[19]。研究發現，在絲氨酸-乙醛酸轉氨酶酶促反應的上游，乙二醇經乙醇酸氧化酶的催化反應生成了乙醛酸和過氧化氫(H2O2)[20]，可以將H2O2作為植物抵抗逆境的信號物質[21]，為進一步研究基因TaAGT2的功能提供了依據。