抗精噁唑禾草靈耿氏硬草乙酰輔酶A羧化酶基因研究

袁國徽，李 濤，錢振官，田志慧，劉偉堂，王金信

(1.上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海 201403; 2.山東農業大學植物保護學院，山東泰安 271018)

耿氏硬草[Sclerochloakengiana(Ohwi)Tzvel.]，又名耿氏堿茅，禾本科硬草屬，是一年生或越年生疏叢型草本[1]。耿氏硬草具有較強的適應能力和繁殖能力，是我國稻麥輪作區小麥田主要惡性雜草之一，通過與作物競爭養分、水分和光照等資源，直接或間接影響作物的產量和品質[2]。據報道，耿氏硬草在部分麥田平均密度達100株·m-2，危害嚴重的田塊可達400 株·m-2，嚴重影響小麥的高產和穩產[3]。

精噁唑禾草靈(fenoxaprop-P-ethyl)，化學名稱為(R)-2-[4-(6-氯-1,3-苯并噁唑-2-氧基)苯氧基]丙酸乙酯，是由德國Hoechst公司開發的芳氧苯氧丙酸類(aryloxyphenoxypropionate，APP)除草劑，其作用靶標為乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)。ACCase是植物體內脂肪酸合成的關鍵酶，它催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A[4]。精噁唑禾草靈通過在植物體內活化成酸的形式與ACCase羧基轉移酶(carboxyltransferase，CT)區域結合，從而抑制丙二酰輔酶A的形成，使植物的脂肪酸合成受阻，最終導致植物死亡[5]。精噁唑禾草靈是選擇性、內吸傳導型苗后莖葉處理劑，具有高效、低毒、殺草譜廣等優點，在我國小麥田被迅速推廣，部分地區已有十幾年的應用歷史。隨著精噁唑禾草靈使用年限的增長，其用量逐年增加，但對耿氏硬草的防除效果卻越來越差，部分地區甚至出現防除失敗。夏書娥等[6]報道，稻茬麥田菵草(Beckmanniasyzigachne)在連續8年使用精噁唑禾草靈后對其產生了抗藥性。趙 寧等[7]研究發現，連續使用精噁唑禾草靈約10年的小麥田中看麥娘(Alopecurusaequalis)也產生了抗藥性。目前，在全球70個國家有255種雜草(148種雙子葉雜草，107種單子葉雜草)的496個生物型對23種不同作用機制的除草劑產生了抗藥性，其中，抗ACCase抑制劑類除草劑的雜草有48種[8]。

已有研究表明，雜草對ACCase抑制劑類除草劑產生抗藥性的機理主要包括：靶標酶基因突變和過量表達，對除草劑滲透和傳導能力的減弱以及解毒代謝能力的提高。報道較多的是雜草ACCase基因突變導致酶結構改變，從而阻礙除草劑與靶標酶結合而產生抗藥性[9]。截至目前，在ACCase的CT區域7個位點(1 781、1 999、 2 027、2 041、2 078、2 088、2 096)上總共有13種不同的氨基酸突變方式在不同的抗性雜草中報道[10]。Délye等[11]研究發現，大穗看麥娘(Alopecurusmyosuroides)ACCase的第1 781位異亮氨酸(Ile)被亮氨酸(Leu)取代而產生抗藥性。Yuan等[12]報道，抗精噁唑禾草靈耿氏硬草ACCase的第1 999位色氨酸(Trp)突變為絲氨酸(Ser)。此外，ACCase第1999位色氨酸突變為半胱氨酸(Cys)也被證實是耿氏硬草對精噁唑禾草靈產生抗性的機理[13]。Yu等[14]報道，雜草對ACCase抑制劑類除草劑的交互抗性與靶標酶突變位點、突變種類以及雜草物種等因素相關。

本研究以采自山東省魚臺縣的抗精噁唑禾草靈耿氏硬草種群為試驗材料，采用整株水平測定法測定供試種群對不同ACCase抑制劑類除草劑的抗性，擴增和比對抗性和敏感種群ACCase基因CT區域序列，并測定耿氏硬草種群對其他常用除草劑的敏感性，為制定耿氏硬草的防除策略和延緩其抗性種群的發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試草種：耿氏硬草抗性種群SD-23種子于2013年6月采自山東省魚臺縣老砦鄉四合村麥田，該麥田約有14年的精噁唑禾草靈用藥歷史；敏感種群SD-1種子采自山東省魚臺縣王魯鎮東華村未使用過除草劑的非耕地。經前期單劑量測定試驗發現，SD-1種群植株在精噁唑禾草靈田間推薦劑量下全部死亡，而抗性種群SD-23植株在2倍田間推薦劑量下生長未見被抑制。

供試除草劑：69 g·L-1精噁唑禾草靈水乳劑、30 g·L-1甲基二磺隆(mesosulfuron-methyl)可分散油懸浮劑，拜耳作物科學(中國)有限公司；15% 炔草酯(clodinafop-propargyl)可濕性粉劑、5% 唑啉草酯(pinoxaden)乳油，瑞士先正達作物保護有限公司；7.5% 啶磺草胺(pyroxsulam)水分散粒劑，美國陶氏益農公司；15% 精吡氟禾草靈(fluazifop-P-butyl)乳油，日本石原株式會社；12.5% 烯禾啶(sethoxydim)乳油，日本曹達株式會社；240 g·L-1烯草酮(clethodim)乳油，北京明德立達農業科技有限公司；70% 氟唑磺隆(flucarbazone-sodium)水分散粒劑，愛利思達生物化學品有限公司；50% 異丙隆(isoproturon)可濕性粉劑，江蘇快達農化股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 耿氏硬草對ACCase抑制劑類除草劑的抗性水平測定

供試材料培養參照Yuan等[15]的方法，將均勻一致的種子用1% 次氯酸鈉溶液消毒20 min，然后用蒸餾水沖洗干凈。經消毒處理后的種子放于含0.6% 瓊脂培養基的培養皿中，置于人工氣候箱內催芽(溫度：白天15 ℃，晚上10 ℃；光照周期：12/12)。待種子萌發后播種于裝有壤土的塑料盆中(直徑12 cm)，每盆15株，放于溫室中培養(溫度15～25 ℃，自然光照，相對濕度75%)。幼苗長至3～4葉期時，使用ASS-4型自動定量噴霧系統進行各除草劑處理，濃度(表1)根據預試驗設定，莖葉噴霧(壓力0.275 MPa，噴液量450 L·hm-2)。每處理設3個重復，試驗重復2次。噴藥21 d后剪取存活植株地上部分，在75 ℃干燥箱內烘干72 h，稱干重。

1.2.2 抗性耿氏硬草ACCase基因分析

根據NCBI上報道的耿氏硬草ACCase基因序列(登錄號KJ598848.1、KJ598849.1)，采用Primer 5.0設計特異性引物YC-F(5′-GCTTCCACTTATCTACTTGGCT-3′)/YC-R(5′-AGGGATTCACCGTCAAATAG-3′)，用于擴增ACCase CT區包含所有已知抗性突變位點的基因片段。

表1 抗性水平測定中除草劑及其處理劑量Table 1 Application amount of herbicide treatments in dose-response tests g(a.i)·hm-2

使用植物基因組DNA提取試劑盒對耿氏硬草抗性和敏感種群進行單株DNA提取，每個種群隨機選取10株。經NanoDrop 2000微量分光光度計測定提取DNA的質量和濃度后，采用T100 PCR儀進行基因片段擴增。PCR反應體系為50 μL，包括：37 μL的ddH2O，1 μL的EasyTaq DNA Polymerase(5 U·μL-1)，5 μL的10×EasyTaq Buffer，4 μL的dNTPs(2.5 mmol·L-1)， 1 μL的引物YC-F(10 μmol·L-1)，1 μL的引物YC-R(10 μmol·L-1)，1 μL的基因組DNA。PCR 反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸 10 min。

PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將含有目的條帶的凝膠進行DNA回收。利用pEASY-T1載體連接回收的DNA片段，然后轉到大腸桿菌感受態細胞Trans1-T1中[7]，涂布于LB固體培養基(含Amp10 μg·mL-1)上，37 ℃培養過夜。挑取白色菌落于LB培養液中37 ℃振蕩培養8～12 h，然后進行菌液PCR鑒定，將陽性克隆送公司測序。通過DNAMANversion 5.2.2 軟件對測序結果進行比對分析。

1.2.3 耿氏硬草對其他除草劑的敏感性測定

采用單劑量測定耿氏硬草對ALS抑制劑類除草劑甲基二磺隆、氟唑磺隆、啶磺草胺和PSⅡ抑制劑類除草劑異丙隆的敏感性。各除草劑處理劑量(有效成分)分別為：氟唑磺隆31.5 g·hm-2，啶磺草胺13.5 g·hm-2，甲基二磺隆13.5 g·hm-2，異丙隆1 197 g·hm-2。耿氏硬草培養及噴藥處理方式同1.2.1，施藥后21 d記錄每處理存活雜草株數，并剪取存活植株地上部烘干后稱重，計算株防效和干重防效。株防效=(對照組雜草株數-處理組雜草株數)/ 對照組雜草株數×100%；干重防效=(對照組雜草干重-處理組雜草干重)/對照組雜草干重×100%。

1.3 數據處理

采用GraphPadPrism version5.01軟件的非線性回歸進行統計分析，計算各藥劑對耿氏硬草抗性與敏感種群的GR50值。擬合方程：y=c+ {(d-c)/[1+(x/GR50)b]}，其中y表示處理組雜草干重相對于對照的百分比，c表示劑量反應下限，d表示劑量反應上限，b表示方程斜率，x表示除草劑處理劑量，GR50表示抑制雜草50%干重的除草劑劑量。通過計算抗性種群GR50與敏感種群GR50的比值得出抗性倍數。利用IBM SPSS Statistics version 20軟件對試驗所得數據進行one-way ANOVA分析。

2 結果與分析

2.1 耿氏硬草抗性種群對ACCase抑制劑類除草劑的抗性

采用整株水平測定法測定了耿氏硬草SD-23種群對6種ACCase抑制劑類除草劑的抗性水平。結果(表2)顯示，SD-23種群對精噁唑禾草靈產生了高水平的抗性，對炔草酯和精吡氟禾草靈產生了低水平的抗性，其抗性倍數依次為12.7、5.2和4.5；對烯禾啶、烯草酮和唑啉草酯未產生抗性，其抗性倍數均小于2。

2.2 耿氏硬草抗性種群ACCase基因分析

對耿氏硬草ACCase基因片段進行克隆與測序后，得到了一段長度為1 359 bp的序列。在NCBI網站進行BLAST分析，確認該堿基序列為耿氏硬草的質體型ACCase基因序列。將耿氏硬草抗性種群SD-23與敏感種群SD-1以及大穗看麥娘的ACCase基因序列進行比較，結果表明，抗性SD-23種群所檢測的10株耿氏硬草均發生了相同的突變，即ACCase基因CT區域第6 287位(參照大穗看麥娘質體型ACCase序列)堿基G突變為C，導致第2 096位氨基酸由甘氨酸(Gly)突變為丙氨酸(Ala)；敏感種群中所有植株均未發現已報道的抗性突變位點(表3)。

2.3 耿氏硬草抗性種群對其他4種除草劑的敏感性

從表4得知，在各藥劑的田間推薦劑量下，抗性種群SD-23與敏感種群SD-1對甲基二磺隆、啶磺草胺、氟唑磺隆和異丙隆的株防效及干重防效之間的P值均大于0.05，所以耿氏硬草種群SD-23與SD-1之間對上述4種除草劑抗性均無顯著性差異。從各除草劑對耿氏硬草種群的株防效和干重防效來看，氟唑磺隆的防除效果最差，其株防效為20.0%～22.2%，干重防效為36.6%～37.8%；而甲基二磺隆、啶磺草胺和異丙隆對耿氏硬草種群均有較好防效，其株防效為86.7%～100%，干重防效為77.4%～84.7%。因此，甲基二磺隆、啶磺草胺和異丙隆可用于抗ACCase抑制劑類除草劑耿氏硬草的防除。

表2 耿氏硬草抗性種群對ACCase抑制劑類除草劑的交互抗性Table 2 Resistance spectrum to ACCase-inbibiting herbicides of the resistant S.kengiana population

c：劑量反應下限；d：劑量反應上限；b：斜率；GR50：抑制雜草50% 干重的除草劑劑量；95% CL：95%置信區間。

c:The minimum dosage;d:The maximum dosage;b:The relative slope; GR50:Herbicide dosage causing 50% plant growth reduction; 95%CL:95% confidence limit.

表3 耿氏硬草抗性與敏感種群ACCase CT區域基因序列分析Table 3 Sequence alignment and deducedamino acid of the resistant and susceptible S.kengiana populations

氨基酸序列位置參照大穗看麥娘質體型ACCase(AJ310767)；突變氨基酸及相應的密碼子在表中用下劃線標出。

The amino acid residue sequence according to the plastidic ACCase sequence ofAlopecurusmyosuroides(AJ310767); the mutated amino acid residues and corresponding codon were underlined.

表4 耿氏硬草抗性種群對其他4種除草劑的敏感性Table 4 Sensitivity of the resistant S.kengiana population to other four herbicides

P>0.05表示抗性種群與敏感種群間無顯著性差異。

Pvalue less than 0.05 means there is no significant difference between the resistant and susceptible populations at 0.05 level.

3 討 論

目前，ACCase抑制劑類除草劑主要有三種類型，分別為芳氧苯氧丙酸類(APP)，環己烯酮類(cyclohexanedione，CHD)和苯基吡唑啉類(phenylpyazoline，PPZ)。本研究中精噁唑禾草靈、炔草酯和精吡氟禾草靈屬于APP類除草劑；烯草酮和烯禾啶屬于CHD類除草劑；而唑啉草酯屬于PPZ類除草劑，是較新的一類ACCase抑制劑類除草劑。由于ACCase抑制劑類除草劑的作用位點單一，長期重復使用該類除草劑極易導致雜草抗藥性的產生。Tang等[16]報道，棒頭草(Polypogonfugax)在連續使用炔草酯和高效氟吡甲禾靈約5年后產生了抗藥性。本研究中，耿氏硬草種群SD-23對精噁唑禾草靈產生了高水平的抗性，這可能與其多年的精噁唑禾草靈用藥歷史有關。Neve等[17]研究發現，雜草群落內本來就存在少數具有抗藥性基因的雜草，除草劑的持續選擇壓力使敏感性雜草數量不斷減少，而抗藥性雜草數量不斷增加并發展成為優勢雜草。

研究表明，ACCase的CT區域氨基酸發生突變是導致雜草對ACCase抑制劑類除草劑產生抗性的重要原因之一[10]。本研究通過對耿氏硬草抗性和敏感種群ACCase基因部分片段進行擴增、測序和比對，結果顯示，抗性種群SD-23的ACCase第2 096位氨基酸由甘氨酸突變為丙氨酸(Gly-2 096-Ala)，這可能是SD-23種群對精噁唑禾草靈產生抗性的重要原因之一，該突變方式是第一次在耿氏硬草中被發現。Gly-2 096-Ala突變是于2005年在抗性大穗看麥娘中被首次報道[18]，隨后Scarabel等[19]在抗性黑麥草屬(Loliumspp.)中也檢測到該突變方式。認為GIy-2096-Ala突變會導致雜草對APP類除草劑產生抗藥性，而對CHD類和PPZ類除草劑敏感。本研究通過整株水平法測定發現，SD-23種群對炔草酯和精吡氟禾草靈產生了抗性，而對烯禾啶、烯草酮和唑啉草酯敏感，此結果與前人的研究相一致[16]。本研究還發現，甲基二磺隆、啶磺草胺和異丙隆等除草劑對耿氏硬草抗性和敏感種群均有較好防效，因此這些除草劑可以作為防治抗ACCase抑制劑類除草劑耿氏硬草的重要選擇。長期施用某單一作用靶標類型的除草劑，極易導致雜草抗藥性的產生[20-21]。Beckie等[22]報道，不同作用機制的除草劑混用或輪用可以有效地延緩和治理產生交互抗性的雜草。

本研究初步明確了耿氏硬草抗性種群的靶標抗性分子機制及其對不同除草劑的敏感性，對生產實踐中合理選擇藥劑防除抗性耿氏硬草及延緩雜草抗藥性的發生具有重要指導意義。本試驗沒有對靶標酶表達量和解毒代謝酶活性等方面進行研究，因此不能排除其對抗性產生的貢獻，這有待后續試驗進行證實。