轉ZmPPDK基因小麥新品系的光合特性及產量分析

齊學禮，李 艷，王玉民，韓留鵬，張 磊，胡 琳，許為鋼

(河南省農業科學院小麥研究所/小麥國家工程實驗室/農業部黃淮中部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/ 河南省小麥生物學重點實驗室/河南省麥類種質資源創新與改良重點實驗室，河南鄭州 450002)

小麥是我國重要的糧食作物，其產量的持續提高對保障我國糧食安全具有重大戰略意義。目前，小麥單產水平的提高主要是由于品種產量潛力遺傳改良和生產條件改善的結果，而產量潛力的遺傳改良主要通過形態性狀改良來實現，但在現有小麥品種產量水平已相對較高、葉面積指數和收獲系數都已接近極限的情況下，再單純依靠形態性狀遺傳改良已很難提高產量[1-4]。因此，小麥產量的進一步提高在一定程度上取決于品種光合生理特性的進一步改善[5-6]。在光呼吸途徑經多基因轉化等技術重新設計后，轉基因煙草和水稻的光合生理特性得到了極大改善，光能利用率、生物量和產量均較野生型對照大幅提高[7-8]。

目前，將丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)、依賴于NADP的蘋果酸酶(NADP-Malic enzyme, NADP-ME)等C4光合途徑關鍵酶的基因轉入到小麥、水稻等C3作物中，改善C3作物光合作用的內在遺傳基礎，實現其光合速率和產量的提高一直是植物生物科學研究的前沿領域和熱點之一[9-16]。其中，PPDK位于葉肉細胞的葉綠體中，催化CO2最初受體磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的再生，該酶催化的反應是C4光合途徑的重要限速步驟[17]。Ishimaru[9-10]首先將玉米C4型PPDK基因導入到擬南芥和馬鈴薯中，獲得的轉基因材料PPDK活性較對照顯著提高，但光合速率提高不顯著；隨后Ku等[11]將該基因轉入到水稻中，使轉基因水稻的光合速率較對照提高35%。本課題組長期開展玉米C4途徑關鍵酶基因轉化小麥的研究，從玉米中分離克隆了高光效ZmPPDK基因[12]，采用基因槍法導入到河南省小麥大面積推廣品種周麥23中，獲得了轉ZmPPDK基因小麥。本研究以其T2代轉基因小麥株系T14和T39為材料，分析了其光合和產量特性，以期為C3植物高光效基因工程與小麥產量遺傳改良研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與田間種植

供試材料為T2代轉ZmPPDK基因小麥株系T14和T39及野生型對照周麥23。2016年10月將試驗材料種植于河南省農業科學院試驗基地，2017年4-6月進行試驗。試驗地耕層土壤有機質含量為12.61 mg·kg-1，堿解氮含量為85.18 mg·kg-1，有效磷含量為29.74 mg·kg-1，速效鉀含量為188.50 mg·kg-1。播種前施雞糞3 000 kg·hm-2和復合肥750 kg·hm-2，小區面積13.37 m2(8.52 m×1.57 m)，基本苗270×104株·hm-2，3次重復，隨機區組排列，常規栽培管理。

1.2 方 法

1.2.1ZmPPDK基因遺傳轉化過程

2015年5月取周麥23灌漿中期(花后15 d左右)的籽粒，用70%的乙醇進行表面消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次，再用0.1%的HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗3次，用解剖刀剝出幼胚，選用1 mm左右的幼胚，放到愈傷組織誘導培養基，于25 ℃暗培養3 d后轉移至高滲培養基，滲透處理5 h后進行基因槍轟擊，將玉米C4型ZmPPDK基因與BAR基因共同導入，完成轟擊后繼續高滲處理16 h，轉至誘導培養基培養14 d，轉至草丁磷抗性篩選(濃度為3 mg·L-1)再生培養基，連續篩選2次，非抗性愈傷褐化死亡，而抗性愈傷則正常生長發育并分化為小麥幼苗(圖1A)，然后將其轉入到生根培養基上，待抗性植株長至10 cm、具有較好的根系時(圖1B)，打開培養瓶蓋子，煉苗3 d后，移栽到花盆中，共獲得具有草丁膦抗性的再生小麥植株190株(圖1C)，2016年10月獲得T0代種子?；驑屴Z擊參數：靶距為9 cm，每槍含質粒DNA1 μg，金粉250 μg，金粉直徑為1 μm，轟擊壓1 100 psi。誘導培養基配方：MS + 2 mg·L-12,4-D + 0.4%瓊脂 + 3%蔗糖，pH 6.2；高滲培養基配方：MS+2 mg·L-12,4-D + 0.7%瓊脂 +甘露醇 (0.4M)+ 3%蔗糖，pH 5.8；分化培養基：1/2 MS + 0.5 mg·L-1NAA + 2.0 mg·L-1KT + 0.4%瓊脂+ 3%蔗糖，pH 6.2；生根培養基配方：1/2 MS + 0.2 mg·L-1NAA + 0.4%瓊脂+3%蔗糖，pH 6.5。

A：抗性愈傷組織；B：抗性植株；C：移栽至花盆的抗性植株。

A: glufosinate-resistant callus; B: glufosinate-resistant plants in culture flask; C: glufosinate-resistant plants transplanted to flower box.

圖1 具有草丁膦抗性的轉基因植株獲得過程

Fig.1 Process from callus to glufosinate-resistant plants

參考柴建芳等[18]的方法，提取拔節期小麥葉片的基因組DNA。以T2代轉ZmPPDK基因小麥葉片基因組DNA為模板進行目的基因PCR檢測，野生型對照周麥23為陰性對照，以轉化的載體質粒為陽性對照，轉基因小麥T14、T39與陽性對照均擴增到了預期的778 bp條帶，陰性對照無目的條帶(圖2)，T14和T39的基因陽性率分別為66.06%和71.43%，表明外源ZmPPDK基因已整合到受體品種周麥23基因組中且可遺傳到下一代植株。

1～3：T14植株；4～7：T39植株；8：野生型對照植株；9：陽性對照；M：DL2000。

1-3:T14 plant;4-7:T39 plant; 8:Wild type plant; 9:Positive control; M: DL2000.

圖2 轉ZmPPDK基因小麥的目的基因PCR檢測

Fig.2 PCR analysis ofZmPPDKgene in transgenic wheat

1.2.2 基因表達量測定

按照天根生化科技(北京)有限公司RNA提取試劑盒說明書，提取開花期和灌漿期(花后 15 d)小麥旗葉RNA；反轉錄試劑盒選用Rever Tre Ace qPCR RT Kit(TOYOBO, Japan)，熒光定量試劑盒選用SYBRPremix Ex TaqTMII，均購于寶生物工程(大連)有限公司。熒光定量反應體系為25 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40循環。基因的引物依據NCBI數據庫中登錄號所對應的序列，利用Primer premier 5.0軟件設計。目的基因和內參基因及其引物見表1。在Bio-Rad CFX96型實時熒光定量PCR儀上進行擴增，3次重復，用2-△△Ct法計算基因相對表達量[19]。

表1 qRT-PCR分析所用引物序列Table 1 Primers for real-time PCR analysis

1.2.3 光合速率測定

在小麥開花期和灌漿期(花后15 d)，選擇晴朗無云的天氣，利用美國PP SYSTEMS公司生產的CIRAS-3型便攜式植物光合作用測定儀，測定小麥旗葉凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)日變化，每2 h測定3次重復，供氣方式選擇大氣供氣，氣體流速設置為300 mL·min-1，光源選擇自然光。

1.2.4 葉綠素熒光參數測定

按照Genty等[20]方法，在小麥開花期和灌漿期(花后15 d)，選擇晴朗無云的天氣，利用英國漢莎公司生產的FMS-2便攜脈沖調制式熒光儀，測定小麥旗葉的最大光化學效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm和實際光化學效率ФPSII=(Fm-Fs)/Fm；按照Strasser等[21]方法，利用英國漢莎公司生產的Handy PEA型連續激發式熒光儀，測定小麥旗葉的K點相對可變熒光WK=(FK-Fo)/(FJ-Fo)和J點相對可變熒光VJ=(FFj-Fo)/(Fm-Fo)，3次重復。

1.2.5 產量性狀測定

灌漿期調查1 m雙行樣段的有效穗數，折合成每公頃穗數。成熟期收獲每小區全部穗子，實打測產，并測定千粒重。

1.3 統計分析

利用DPS 7.05進行統計分析，用LSD法進行多重比較，Microsoft Excel 2010繪圖。

2 結果分析

2.1 轉基因小麥的旗葉光合速率日變化

測定結果(圖3)表明，轉基因小麥T14和T39及野生型對照(WT)開花期和灌漿期的旗葉光合速率(Pn)日變化趨勢一致，均呈現典型的“雙峰”曲線，T14和T39的Pn值在10:00- 14:00顯著高于WT。開花期T14和T39的最大Pn值分別為25.6和26.0 μmol·m-1·s-1， 14:00時Pn值與WT差異最大，分別較WT提高 12.46%和12.27%；灌漿期最大Pn值分別為 22.8和 21.9 μmol·m-2·s-1，12:00Pn值與WT差異最大，分別較WT提高17.24%和21.11%。

2.2 轉基因小麥光合基因的表達變化

經檢測，與WT相比，開花期轉基因小麥T14和T39的ZmPPDK及內源基因CA、NADP-ME、FBP的表達量均顯著升高，其中ZmPPDK的表達量升高幅度最大，較WT分別提高9.27和10.40倍；灌漿期ZmPPDK、CA、NADP-ME、FBP基因的表達量較開花期均顯著降低，但4個基因在轉基因小麥T14和T39中的表達量仍顯著高于WT，且增幅高于開花期，其中ZmPPDK基因增幅最大，分別較對照提高14.13和15.28倍(圖4)。

曲線上同一時刻數據上標注的不同小寫字母表示材料間差異顯著(P<0.05)。

Data at the same time followed by different letters are significantly different among the materials at 0.05 level.

圖3 轉ZmPPDK基因小麥與野生型對照(WT)的光合速率日變化

Fig.3 Diurnal variation of net photosynthetic rate in transgenic wheat and WT

柱狀圖上不同小寫字母表示材料間差異顯著(P<0.05)。圖5同。

Different letters above the columns are significantly different among the materials at 0.05 level.The same in figure 5.

圖4 外源ZmPPDK基因及內源光合相關基因在轉基因小麥與野生型對照(WT)中的表達量

Fig.4 Relative expression levels ofZmPPDKand genes related to photosynthesis in transgenic wheat and WT

2.3 轉基因小麥的葉綠素熒光參數變化

8:00時轉基因小麥的葉綠素熒光參數Fv/Fm、ΦPSII、WK、VJ值與WT均無顯著差異(圖5)。13:00時由于高溫強光的脅迫，轉基因小麥和WT的Fv/Fm和ΦPSII值均顯著下降，但T14與T39顯著高于WT；小麥WK與VJ值較8:00均顯著上升，但T14與T39顯著低于WT。這說明轉基因小麥PSII的活性、光化學效率和電子傳遞能力均優于野生型對照。

2.4 轉基因小麥的產量特點

與WT相比，轉基因小麥T14與T39的產量兩年均顯著增加，兩年平均產量的增幅分別為 6.40%和5.02%；轉基因小麥的成穗數和穗粒數無顯著變化，而千粒重顯著增加，兩年平均千粒重的增幅分別為6.63%和6.81%。這說明轉基因小麥增產的主要原因是千粒重增加(表2)。

A～D:開花期，E～H:灌漿期。 A-D:Anthesis stage; E-H:Grain filling stage.

圖5 轉ZmPPDK基因小麥與野生型對照(WT)在8:00與12:00的葉綠素熒光參數

同列數據后的不同小寫字母表示材料間差異顯著(P<0.05)。

Data in same column followed by different letters are significantly different among the materials at 0.05 level.

3 討 論

植物學家和作物育種學家一直都致力于將C4途徑的光合關鍵酶轉化到C3植物中，以達到提高C3作物光合效率，進而提高生物量和產量的目的。許多研究人員開展了將C4光合途徑關鍵酶基因PPDK轉化C3植物的研究[9-13]。Ku等[11]將玉米C4型PPDK基因轉入到水稻后，轉基因水稻的光合速率較對照提高35%。本研究也發現，在開花期和灌漿期轉ZmPPDK基因小麥T14和T39的10:00-14:00光合速率顯著高于野生型對照，最高可增加21.1%。但Ishimaru等[9-10]將玉米C4型PPDK基因導入到擬南芥和馬鈴薯后，轉基因擬南芥和馬鈴薯的光合速率沒有提高。上述結果說明，玉米C4型PPDK基因在不同C3植物中表現出的功能不盡相同，這可能與不同作物的遺傳背景不同有關。此外，本課題組獲得的轉ZmPPDK基因小麥中部分株系的光合速率與野生型對照相比無差異或降低(未發表數據)，這可能是基因插入位點與拷貝數不同所致。因此，轉基因小麥新品種培育成功的前提是獲得一定數量的轉基因株系，轉化體數量少則難以從中篩選出目標性狀較對照顯著改善的株系。

通過研究轉基因小麥與對照的光合速率日變化發現，轉基因小麥在10:00-14:00期間的光合速率顯著高于野生型對照，其他時間則無顯著差異。10:00-14:00是一天中氣溫最高的時刻，特別在小麥生育后期更是強光高溫同時存在的時刻，說明轉基因小麥較對照具有更好的耐強光高溫特性，表現出了類C4植物特性。秦立琴等[28]和金立橋等[29]通過測定花生和黃瓜的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線，發現強光高溫脅迫影響植物的PSII活性。本研究表明，在中午13:00強光高溫脅迫時刻，轉基因小麥較對照具有較好的最大光化學效率和實際光化學效率，且PSII的電子供體側與受體側受傷害程度均顯著低于對照，說明在中午強光高溫等逆境脅迫下轉基因小麥的電子傳遞鏈活性顯著優于對照，可為暗反應階段提供更多的能量，進而維持較高的光合速率。

在小麥生育后期經常遭遇高溫、強光等逆境，影響小麥籽粒發育，降低千粒重[30]。超高產小麥的生育后期旗葉功能顯著優于中產小麥，有利于形成高千粒重[31]。本研究發現，轉基因小麥的千粒重顯著高于對照，是其增產的主要因素，這主要因為外源ZmPEPC基因可提高小麥生育后期的光合速率，進而促進后期同化物生產和積累，為籽粒灌漿提供充足的底物，最終形成較高的千粒重，也說明轉ZmPEPC基因小麥在生育后期較對照具有更好耐高溫強光特性。Gu等[32]研究發現，干旱脅迫下玉米PPDK基因可提高水稻的千粒重和產量，與本研究結果相似。有關PPDK基因提高小麥千粒重的分子機制有待深入研究。