廣西‘金都一號’火龍果組培技術①

李清香 吳紅英

(欽州市林業科學研究所 廣西欽州535099)

火龍果（Hylocereus undatus），植物學名是量天尺 ［Hylocereus undatus（Haw.） Britt.et Rose］，是仙人掌科（Seleniereus）量天尺屬［Hylocereus（Berg.） Britt.et Rose］ 多年生攀援肉質灌木，又名紅龍果、青龍果、仙蜜果、玉龍果，原產中美洲至南美洲北部，世界各地廣泛栽培［1］。火龍果因其外表肉質鱗片似蛟龍外鱗而得名，具有豐富的營養價值，是一種低熱量、高纖維的水果［2-3］，符合現代人對營養、健康的需求，是近年來受消費者和種植戶廣泛關注的一種新興熱帶亞熱帶果樹。廣西‘金都一號’火龍果（桂審果2016007號）是廣西南寧金之都農業發展有限公司從中南美洲火龍果原種與紅肉種的雜交后代中選育而成。該品種屬于紅皮紅肉，自花授粉，不易裂果，果實甜度高，在廣西、廣東和海南廣泛種植，是市場熱銷品種之一。由于種植面積逐年擴大，對火龍果苗木的需求也不斷增加。采用種子繁殖，繁殖后代易變異，無法保持品種的優良特性。采用無性繁殖，可以保持品種的優良特性，目前火龍果育苗方式就是以扦插或嫁接為主的無性繁殖。但是傳統的扦插育苗和嫁接育苗，繁殖數量完全不夠市場的需求，而植物組織培養方式卻可以在短時間內繁育大量品質保持一致的苗木，因此研究火龍果組培育苗技術顯得尤為重要。中國火龍果組培技術研究起步比較晚，2000年以后才開始有零星報道［4-15］，火龍果組培技術開發的成功試驗中，大多數研究以火龍果莖段為材料，開展外植體消毒、無菌芽誘導、繼代增殖和生根誘導試驗，篩選最佳培養方式方法，建立火龍果組培技術體系。隨著火龍果品質的不斷提升，近五年來火龍果開始到得到大眾青睞，商業栽培的優質品種，如‘金都一號’、‘桂紅龍’、‘大紅’等，經濟效益高、品質穩定，種植面積逐年增加。由于‘金都一號’是新選育出來的且已通過區域審定的品種，市場需求量大，通過組培快繁技術可以有效提供品質一致的苗木。通過查閱文獻可知，近年來有關‘金都一號’組培技術的研究報道很少，僅有洪青梅等［16］有針對性地對該品種進行外植體誘導的研究，而未有其系統的研究成果，無法建立‘金都一號’組培技術體系。因此，很有必要在前人的研究基礎上開展‘金都一號’組培技術的研究，初步建立一套‘金都一號’組培技術體系，為后續的研究提供重要參考資料，從而為新品種的推廣提供優質苗木。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

廣西欽州市林業科學研究所于2016年引種‘金都一號’，為了保證母株的安全，杜絕外界病毒的感染，引進的‘金都一號’種植于大棚內。本研究的所需材料均出自其新萌芽的莖段，將新萌芽的莖段剪下來帶回實驗室，先用清水沖洗，同時用毛刷輕輕刷洗刺座位置，將外植體表面的泥沙沖洗干凈，然后瀝干水份，裝入干凈的杯子備用。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒試驗

本試驗選擇75%酒精和0.1%升汞2種常規的消毒劑，采用2種消毒方式（0.1%升汞、75%酒精＋0.1%升汞），其中升汞消毒時間分別為5、10、15min，75%酒精消毒時間為20 s。

將處理好的外植體放到超凈工作臺上，按設計方案依次操作，最后用無菌水清洗3～4次，每次沖洗1～2 min，瀝干表面水分；切掉外植體切口壞死的部分肉莖，然后把外植體切割成每段帶有2～3個刺座的莖段，垂直插入預培養基中，每個處理接種20瓶，重復3次，每瓶接種1個莖段；接種后7 d檢查污染情況，統計污染數。

1.2.2 無菌芽誘導試驗

以MS為基礎培養基，附加不同濃度的植物生長調節劑 6-BA （1、5、8、11） mg/L、NAA （1、0.1） mg/L，對外植體進行誘導試驗，觀察不同配方對外植體誘導無菌芽的效果。將經過預培養后未污染、外植體顏色未變、切口愈傷組織正常的莖段進行切割，切割時以莖段棱柱的中心點為切割點，把棱柱縱向切割成3個棱邊，然后再橫向切割成帶1個刺座的組織塊，轉入無菌芽誘導培養基，注意刺座不要插入培養基中，以免影響萌芽；每個處理接種30瓶，重復3次，每瓶接種1個組織塊；接種后40 d觀察無菌芽萌發情況，統計無菌芽誘導成功數。

1.2.3 增殖培養試驗

以MS為基礎培養基，以不同倍量大量元素（1/2、1、3/2）、不同濃度的植物生長調節劑6-BA（0.5、1、2） mg/L、NAA （0、0.1、0.2） mg/L組合的配方，設計3個因素各3個水平的正交試驗，選擇L9（34）正交表，共計9個處理，對無菌芽進行增殖培養試驗，每個配方配制30瓶培養基；將無菌芽接種到增殖培養基，共9個處理，每個處理接種10瓶，重復3次，每瓶培養基接種一個完整芽；接種45 d后將新萌發的芽條切割成長度一致的莖段，轉入新鮮培養基（培養基配方不變）培養，培養周期均為45 d，連續培養3代（周期），抽檢記錄增殖數量及生長情況，統計繼代增殖系數。

1.2.4 生根培養試驗

以MS為基礎培養基，以不同倍量大量元素（1/2、1）、不同濃度的生根劑 ABT6（0、0.5、1）mg/L、 IBA （0、 0.5、 1） mg/L、 NAA （0、 0.1、0.2）mg/L組合的配方，設計2水平1因素和3水平3因素的正交試驗，選擇L18（2×37）正交表，對火龍果不定芽進行生根誘導試驗，共計18個處理。

將增殖培養得到的叢生芽的頂芽進行切割，每段長度約2 cm，垂直插入生根誘導培養基，共18個處理，每個處理接種10瓶，重復3次，每瓶接種6個頂芽；接種后30 d統計每瓶生根株數、每株生根數、平均根長及株高。

1.2.5 培養條件

預培養基為無激素的MS培養基，預培養基、無菌芽誘導培養基及增殖培養基均加入蔗糖30 g/L、瓊脂（強度為1 200）3.0 g/L，除增殖培養基需要指定pH值外，其余配方pH均為5.8；生根培養基加入蔗糖15 g/L、瓊脂3.2 g/L、pH 6.0。按常規要求將各個培養基進行配制、高壓滅菌、靜置冷卻備用。培養室溫度26～28℃，每天光照13～14 h，光照強度2 000～5 000 lx。

1.2.6 數據處理

使用Excel2007和SPSS17.0數據處理系統進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方式及消毒時間對外植體消毒效果的影響

采用不同消毒方式與消毒時間對火龍果外植體進行消毒試驗，其結果見表1。消毒效果最好的是處理5，污染率為55.70%；其次是處理6，污染率為57.23%；最差的是處理1，污染率為91.83%。

通過對以上結果進行單變量雙因素方差分析（表2）可知，雙因素均達到顯著差異，即不同消毒方式與消毒時間對外植體污染影響達到顯著水平。2種消毒方式的消毒效果達到顯著差異，最好的消毒方式是復合消毒（即75%酒精＋0.1%升汞）。3個水平消毒時間的消毒效果也達到顯著差異，其中消毒時間為5 min的消毒效果與10和15 min消毒效果達到顯著性差異，而消毒時間為10和15 min的消毒效果沒有顯著性差異，因此合適的消毒時間為10和15 min。

表1 廣西‘金都一號’火龍果外植體消毒試驗結果

表2 不同消毒組合及消毒時間對外植體污染率的影響結果

綜上，火龍果外植體消毒最佳方式為處理5和處理6，即先用75%酒精消毒20 s后，再用0.1%升汞消毒10～15 min。

2.2 不同培養基誘導無菌芽效果

以MS為基礎培養基，附加4個濃度6-BA與2個濃度NAA，共計8種培養基（即8種處理），試驗結果見表3。誘導率最高的是6號培養基，為85.56%；其次是5號培養基，為83.33%；最差的是1號和3號培養基，僅為2.22%和3.33%。

通過對以上數據進行單因變量雙因素方差分析（表4）可知，不同濃度的6-BA對無菌芽誘導結果影響達到顯著性差異，6-BA對誘導率影響很大，其中6-BA濃度為8.0 mg/L的培養基誘導效果最好，濃度為1.0 mg/L的培養基誘導效果最差。不同濃度的NAA對無菌芽誘導結果的影響未達到顯著性差異，即NAA對誘導率影響不大。

綜上，火龍果外植體誘導最適合的培養基為：MS附加6-BA 8.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L（即6號培養基），誘導的無菌芽如圖1所示。

表3 廣西‘金都一號’火龍果無菌芽誘導試驗結果

2.3 不同培養基增殖效果

不同培養基增殖效果如表5所示。經分析可知：平均增殖系數最高的是6號培養基，為7.13；其次是處理9，為6.67；最差的是1號培養基，僅4.07。對試驗數據進行極差分析可知，對增殖系數影響的主次關系為A＞B＞C，初步篩選最優組合為A2B3C1（即6號培養基）。為了進一步驗證各因素間的顯著性，對正交試驗結果進行單變量多因素方差分析，結果顯示各因素F值均小于p（0.05），因此各因素對火龍果增殖系數的影響均達到顯著性差異。通過Duncan法對各因素各水平進行多重比較（表6）可知，A因素中水平2與水平3差異不顯著，但與水平1差異顯著，其增殖系數從高到低依次為A3＞A2＞A1；B因素中3個水平的增殖系數均達到顯著差異水平，其增殖系數從高到低依次為B3＞B2＞B1；C因素中水平水平2和水平3差異不顯著，但與水平1差異達到顯著性，其增殖系數從高到低依次為C1＞C3＞C2。通過方差分析篩選出最佳組合為A2B3C1，該組合正是正交試驗中增殖系數最高的6號培養基。

表4 不同6-BA及NAA濃度對火龍果無菌芽誘導的影響

圖1 6號培養基誘導的無菌芽

表5 廣西‘金都一號’火龍果繼代增殖試驗結果

表6 不同大量元素、6-BA及NAA濃度對火龍果繼代增殖的影響結果

綜上，火龍果增殖培養基配方最佳組合為：MS＋6-BA 2.0 mg/L（即6號培養基），增殖培養1～3代苗木生長情況如圖2所示。

2.4 不同培養基生根效果

生根誘導試驗結果見表7所示。5號培養基生根率最高，為93.33%；其次是14號培養基，為89.44%；最差的是1、4、13號培養基，生根率不到10%。為了檢驗各因素之間的顯著性，對試驗數據進行單變量多因素方差分析，其結果顯示各因素F值均小于p（0.05），因此各因素對火龍果生根率的影響均達到顯著性差異。通過利用Duncan法對各因素各水平進行多重比較（表8）可知，各因素各水平對火龍果生根率的影響均達到顯著性差異，最佳組合為A2B2C2D2。由于篩選的最佳組合不在正交試驗中，所以補做此組合的驗證試驗，測得生根率為98.56%，高于正交試驗中生根率最高組合A1B2C2D2（即5號培養基），苗壯根粗，分枝少。

圖2 6號培養基增殖培養（從左至右，依次是第1代、第2代、第3代）

表7 廣西‘金都一號’火龍果生根試驗結果

表8 不同大量元素MS、ABT6、IBA及NAA濃度對火龍果生根率的影響結果

綜上，火龍果生根誘導最佳培養基配方是：MS＋ABT60.5 mg/L＋IBA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，生根苗木長勢如圖3所示。

圖3 廣西‘金都一號’生根培養（左圖是5號培養基苗木長勢，右圖是調整后最佳配方）

3 討論與結論

3.1 外植體污染問題

外植體消毒一般使用組合消毒方式，其中最常用組合是 75%酒精與 0.1%升汞［4-6，13，16］，酒精能夠滲透到菌體內，使組成菌體的蛋白質凝固，從而殺死外植體表面的菌類。值得注意的是酒精濃度以75%消毒效果最佳，過低或過高濃度的酒精殺菌效果會降低很多。升汞是一種殺菌力很強的殺菌劑，主要靠汞離子進入菌類細胞內，使細胞失活或變性，從而達到消毒作用。微量的升汞還能在細胞內不斷累積并最終對生物體產生毒害作用。因此，使用75%酒精與0.1%升汞組合消毒外植體時，消毒時間一定要掌握恰當，因為消毒劑在殺死菌類的同時也會殺死外植體，尤其是外植體切口處、幼嫩部位受毒害最嚴重［13］。本研究使用75%酒精消毒20 s、再用0.1%升汞消毒10～15 min的組合方式對火龍果外植體進行表面消毒，污染率為55.70%，這個組合方式的消毒效果最好。

火龍果莖段外植體表面光滑，芽眼的刺座處一般污染比較嚴重，這是因為芽眼處長有成叢的葉刺，容易窩藏較多的雜菌，雖然用毛刷刷洗，但也難以清洗干凈，消毒劑也較難滲入，因此容易因消毒不徹底而造成污染［6，14］。雖然本研究對火龍果外植體進行（如移植大棚內培養、毛刷刷洗刺座處、洗潔精浸泡等）預處理，但是絕大部分污染還是出現在刺座處，因此對火龍果外植體消毒方法還需作進一步研究。

3.2 繼代培養

火龍果初代培養，也叫啟動培養，需要較高濃度的細胞分裂素刺激才能分化出無菌芽，當然不是越高越好，本研究中當6-BA濃度達到8 mg/L時，誘導率最高，達到85.47%，低于或高于該濃度，誘導率達不到50%。相對于初代培養，繼代培養卻不能使用高濃度細胞分裂素，因為容易出現畸形芽，本研究繼代增殖培養基中6-BA使用濃度為2.0 mg/L時，增殖系數達到最高。除了激素外，影響繼代培養的還有大量元素、微量元素及有機物，本研究就大量元素半量、全量和倍量3種不同濃度進行對比試驗，其中全量和倍量表現突出，綜合考慮以全量為最佳選擇。因此最終篩選出火龍果繼代適宜培養基為MS＋6-BA 2.0 mg/L，增殖系數為7.13。本研究結果與很多報道的結果不同［6-7，10］，如與周傳明等［6］研究結果剛好相反，其誘導腋芽最佳培養基是MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，最佳增殖和繼代培養基均是MS＋12.0mg/L＋NAA 0.1 mg/L，這可能是不同品種適合不同的培養配方。

3.3 生根培養

火龍果為多年生肉質植物，生長旺盛，萌芽力和發枝力較強，易生氣生根，此生物特性有利于其組培生根培養［15］，因此火龍果屬于比較容易誘導根系的樹種，但是也容易誘導出過多氣生根、分枝，影響生根苗質量。火龍果生根誘導培養基中一般大量元素為半量，即 1/2［4，11，13-14］，主要是因為營養元素減少可抑制側芽萌發，從而促進根系生長，達到誘導出根的效果。本研究中大量元素使用半量的培養基生根率達到93.33%，苗壯根粗，分枝少，效果也不錯，但是通過分析及驗證，最終篩選的最佳配方是MS＋ABT60.5 mg/L＋IBA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，生根率達到98.56%，苗壯根粗，分枝少。因此不同品種對培養基配方要求不同，需要科技人員通過科學試驗進行篩選。