果蔬中雙甲脒殘留量氣質聯用快速測定方法①

梁曉涵 黨 政 楊雅雅 王 丹

(1海南省食品檢驗檢測中心 海南海口570314；2海南省食品藥品檢驗所儋州分所 海南儋州571700)

雙甲脒是一種廣譜性甲脒類殺蟲殺螨劑，具有多種毒殺機制，主要用于果樹、蔬菜、茶葉、棉花、大豆等作物的除螨，對部分鱗翅目類害蟲卵有效，還可用于牛羊等牲畜防治蜱螨。雙甲脒對人、畜有一定的毒性，對人體中樞神經系統能產生抑制作用，中毒后無特效藥物，其主要水解代謝產物2，4-二甲基苯胺具有高毒性，對人體有致癌、致突變等多種潛在危害［1-2］。因此，澳大利亞、日本、韓國等國家和地區對食品中的雙甲脒殘留限量做了嚴格的規定，中國國家標準［3］也規定了食品中雙甲脒的最大殘留限量：0.05～0.5 mg/kg，為雙甲脒及N-（2，4-二甲苯基）-N′-甲基甲脒之和，以雙甲脒表示。

目前，常用的雙甲脒的檢測分析方法氣相色譜 法［4-7］、氣質聯用法［8-13］、液相色譜法［14］和液質聯用法［15-16］，現行果蔬中雙甲脒的測定使用GB/T 5009.143-2003國標法，然而該標準采用填充柱進行色譜分離、前處理需回流裝置水解、水解產物還得衍生化后再測定，方法嚴重滯后給現代實驗室檢測工作帶來諸多不便和困擾。已報道的雙甲脒測定方法原理大致相同，經酸或堿水解后測定其水解終產物，換算成雙甲脒含量計。近年來，未見有針對果蔬中雙甲脒氣質聯用法測定的研究報道。因此，建立更科學、便捷、廣泛適用的檢測果蔬中雙甲脒總殘留量的分析方法具有重要意義。本研究采用雙甲脒測定的主流氣質法，對果蔬中雙甲脒及其代謝物測定的前處理進行了優化，對水解方式和產物、水解條件及效率、基質效應、標準曲線的選擇等方面進行探討，驗證該方法的可靠性及準確性，并對實際樣品進行大批量檢驗，獲得良好的效果。本研究結果對果蔬中雙甲脒及其代謝物殘留量的檢測提供了可行的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

7890B/7000C氣相色譜-質譜聯用儀（Agilent，美國）；ProBlend 6攪拌機（Philips，德國）；AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多，瑞士）；50 mL聚四氟乙烯微波消解罐（LabTech，北京）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器，中國）；Multi Reax全能型渦旋振蕩器（Heidolph，德國）；Centrifuge 5804 R離心機（Eppendorf，德國）；Milli-Q Advantage A10超純水系統（默克-密理博，德國）。

1.1.2 試劑和標準物質

濃鹽酸（GR，廣州化學試劑廠）；氫氧化鈉（AR，阿拉丁）；水為超純水；丙酮（色譜純，Merck KGaA）；正己烷（色譜純，Merck KGaA）；雙甲脒標準品（Dr.Ehrenstorfer，純度 99.8%，CAS：33089-61-1，批號 G128883）；2，4-二甲苯胺標準品（Dr.Ehrenstorfer，純度99.3%，CAS：95-68-1，批號G131417）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

鹽酸溶液（1 mol/L）：量取86 mL濃鹽酸，用超純水溶解并稀釋至1 L。氫氧化鈉溶液（2 mol/L）：稱取80 g氫氧化鈉，用超純水溶解并稀釋至1 L。雙甲脒標準儲備溶液：精確稱取0.010 0 g的雙甲脒標準品，用丙酮定容于10.0 mL容量瓶，得1.00 mg/mL雙甲脒標準儲備液（置于-18℃以下保存，可穩定6個月），再根據需要，臨用前用丙酮稀釋。2，4-二甲基苯胺標準儲備溶液：精確稱取0.010 0 g的2，4-二甲基苯胺標準品，用丙酮定容于10.0 mL容量瓶，得1.00 mg/mL 2，4-二甲基苯胺標準儲備液（置于-18℃以下保存，可穩定6個月），再根據需要，臨用前用丙酮稀釋。

1.2.2 色譜條件

氣相色譜條件：DB-1MS色譜柱（30 m×0.250 mm×0.25 μm，內層涂以100%聚二甲基硅氧烷）；進樣口溫度：230℃，不分流進樣；MSD傳輸線溫度：280℃；載氣：氦氣，柱流速：2.0 mL/min；程序升溫：初溫60℃，保持3 min，以25℃/min升至280℃，保持5 min；進樣量：1.0μL；

質譜條件：EI源；電子能量：70eV；離子源溫度：300℃；四級桿MS1溫度：180℃；四級桿MS2溫度：180℃；碰撞氣：氮氣；采集方式：多離子反應監測（MRM）模式；監測的特征離子對2，4-二甲基苯胺MRM條件參數為定量離子對 （碰撞能量）121＞106（10） M/Z（eV），輔助定性離子對（碰撞能量）120＞77（10）M/Z（eV），輔助定性離子對（碰撞能量）106＞77（20）M/Z（eV）；保留時間（RT）：（6.31±0.1）min。

1.2.3 測定方法

試樣前處理：取代表性果蔬樣品約1.0 kg，切碎混勻攪拌機攪碎制成勻漿。

試樣制備：準確稱取果蔬勻漿試樣10.00 g于50 mL聚四氟乙烯微波消解罐中，加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液，混勻，于電熱鼓風干燥箱中120℃靜置水解30 min，水浴冷卻后，加入10 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻，轉移至50 mL離心管，加入5 mL正己烷，于2 000 r/min高速渦旋振搖5 min，液液萃取，后以8 000 r/min離心5 min，收集有機相至10 mL容量瓶，下層水相再加5 mL正己烷萃取一次，合并有機相并用正己烷定容，待上機。

雙甲脒標準溶液系列的制備：取1.00 mg/mL雙甲脒標準儲備液，用丙酮稀釋至50.0μg/mL，再用超純水分別配制成濃度為5、20、50、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL標準溶液于25 mL容量瓶中，分別準確吸取10.0 mL于50 mL聚四氟乙烯微波消解罐中，加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液，混勻，于電熱鼓風干燥箱中120℃靜置水解30 min，水浴冷卻后，加入10 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻，轉移至50 mL離心管，加入5 mL正己烷，于2 000 r/min高速渦旋振搖5 min，液液萃取，后以8 000 r/min離心5 min，收集有機相至10 mL容量瓶，下層水相再加5 mL正己烷萃取1次，合并有機相并用正己烷定容，得同上濃度的系列標準工作溶液，分別進樣1.0μL于GC-MS/MS中分析，以定量離子對的響應值為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。

試樣測定：進樣1.0 μL于GC-MS/MS中分析，測得其響應值，根據保留時間、所選監測離子對和離子對豐度比定性，用外標法定量樣品處理液中2，4-二甲基苯胺含量，即相當于樣品處理液中雙甲脒含量。

2 結果與分析

2.1 方法的確定

2.1.1 譜圖

2，4-二甲基苯胺標準溶液MRM總離子流圖及選擇監測離子色譜圖和質譜圖見圖1、圖2和圖3。

2.1.2 標準曲線與檢出限

在本試驗條件下，雙甲脒水解產物標準工作曲線在5～2 000 ng/mL范圍內其響應與質量濃度呈現良好的線性關系，其回歸方程為y=7 189.809 3x-137.620 0，相關系數γ為0.999 4，檢出限為0.005 0 mg/kg。

2.1.3 加標回收率和相對標準偏差

在6種果蔬樣品空白中，分別加入表1所示濃度的雙甲脒，按本文方法處理，每個添加濃度分別測定6次，得到加標回收率和相對標準偏差RSD。結果表明：雙甲脒在6種果蔬樣品中的加標回收率均值為 70.4%～92.9%，RSD為 1.87%～6.55%（表1），本方法的準確度和精密度良好。辣椒樣品空白和其樣品空白加標的總離子流圖見圖4和5，茄子樣品空白和其樣品空白加標的總離子流圖見圖6和7。

圖1 2，4-二甲基苯胺標準溶液總離子流圖（TIC）

圖4 辣椒樣品空白總離子流圖（TIC）

圖5 辣椒樣品空白加標總離子流圖（TIC）

圖6 茄子樣品空白總離子流圖（TIC）

圖7 茄子樣品空白加標總離子流圖（TIC）

表1 6種果蔬樣品的加標回收率均值和相對標準偏差

2.1.4 樣品測定結果

采用該方法對市場監督抽查的3批次共105份果蔬樣品，包括32份番茄、26份黃瓜、19份茄子、15份辣椒、購自超市的13份蘋果、梨等樣品按建立的方法進行測定，雙甲脒檢出濃度范圍在0.01～0.16 mg/kg，檢出率為11%，樣品中雙甲脒殘留量均未超國家標準限值［3］（蔬菜和水果中最大殘留限量為0.5 mg/kg）。

2.2 測定條件的優化分析

2.2.1 水解條件的選擇和優化

試驗對兩組水解反應程度進行了比較，以期得到最優化的水解條件。

第一組，酸水解與堿水解介質的選擇，實驗對比見表2，水解處理液經全掃SCAN模式，檢索NIST MS庫匹配化合物質譜圖確證水解產物種類。結果表明：在酸或堿濃度及雙甲脒濃度、水解時間一致，只改變水解溫度條件下，酸水解比堿水解速率高、效果好；水解溫度越高、時間越長，水解進程越徹底，但溫度過高，水解產物會進一步消解。

表2 水解介質的選擇

第二組，在雙甲脒標液濃度均為1.0μg/mL、水解溫度為120℃條件下，加入不同濃度的鹽酸溶液，轉化率見圖8。結果表明：酸濃度適當增大，水解加劇，隨著水解時間延長，轉化率不斷增大，30 min后基本達到平衡，水解基本完全，HCl介質為1 mol/L時轉化率保持在95%～99%，但酸濃度過大，水解時間過長，也會造成水解終產物進一步消解。故本文選擇最佳水解條件為加1 mol/L HCl，于電熱鼓風恒溫干燥箱中120℃放置30 min。

2.2.2 基質效應的影響分析

質譜法農殘檢測通常會考慮基質效應帶來的影響，對樣品空白處理液采用標準加入法進行基質效應分析，分別取辣椒、黃瓜、茄子、西紅柿、梨、蘋果6種果蔬樣品空白基質溶液各1.0 mL，準確加入50.0 μg/mL 2，4-二甲基苯胺標準溶液各20.0 μL，與同濃度1.0 μg/mL 2，4-二甲基苯胺正己烷溶劑標準溶液的測定峰面積響應值比較（表3），得到基質標液響應值與純溶劑標液響應值的比值為93.1%～113.0%。測定結果表明樣品處理液基質效應微乎其微，不存在明顯的基質增益或抑制現象。

圖8 酸濃度與水解時間對水解轉化率的影響

表3 2，4-二甲基苯胺在純溶劑與基質溶液中的測定響應比較

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 檢測器的選擇

雙甲脒及代謝物N-（2，4-二甲苯基）-N′-甲基甲脒即單甲脒在氣相GC-ECD上基本無響應，其水解產物2，4-二甲基苯胺在ECD檢測器上響應很小，檢出限高，且樣品雜峰的干擾容易導致假陽性判斷。而2，4-二甲基苯胺經七氟丁酸酐衍生生成2，4-二甲基苯七氟丁酸胺后雖在ECD檢測器上有強響應，抗基質干擾效果顯著，但七氟丁酸酐衍生反應進行緩慢，需后續處理，操作繁瑣耗時，加之七氟丁酸酐高毒，會引發急性毒性，對操作者安全健康很不利。因此，本研究樣品水解液堿化后經正己烷液液萃取，再采用GC-MS/MS直接分析2，4-二甲基苯胺，避免進一步凈化造成的目標物損失，以保留時間和質譜雙重定性，選擇監測離子對定量，可靠性也更高、抗干擾力更強，能很好的減小雜質干擾帶來的影響，對于種類多樣、多色素、多糖、含多種有機酸等復雜基質的果蔬樣品非常適合，本底低、噪音小，靈敏度也更高。

3.1.2 水解產物的分析

雙甲脒及代謝物單甲脒農殘的檢測不直接測其本體，是因為雙甲脒易發生水解反應，在自然環境下會緩慢水解為單甲脒，隨時間的延長，單甲脒又進一步水解為2，4-二甲基苯基甲酰胺、2，4-二甲基苯胺，還有小分子的甲胺、甲酸［17］等。其水解可在酸或堿條件的催化下加速進行，水解速率與酸堿液的濃度相關，濃度越大，水解越快。水解分步進行，終產物一致［15-17］，所以若雙甲脒水解進行不完全，會產生以上多種中間產物，導致終產物2，4-二甲基苯胺轉化率不高、回收不理想。因此使其水解轉化徹底，再以2，4-二甲基苯胺含量換算雙甲脒含量，方法科學、準確。

3.1.3 水解方式的選擇

雙甲脒及其代謝物的水解可用微波消解罐在電熱鼓風干燥箱中恒溫進行，罐中高溫高壓使得水解反應速率呈倍增長，加快水解進程、縮短水解時間、促進反應徹底，較之文獻方法采用的低溫水解及國標法采用的回流水解，優勢明顯：可實現水解反應轉化完全，多樣品同時進行前處理，還省去了回流、冷凝裝置的安裝過程，極大的簡化操作流程、提高工作時效、省時、省力、省空間。

3.1.4 標準曲線的選擇

采用標準工作曲線，配制一組濃度呈梯度的雙甲脒標準溶液與樣品同時進行前處理（經水解、萃取）后，用得到的標準溶液處理液上機測定，由于多種樣品的基質干擾效應并不明顯，無需加入基質溶液，即得系列2，4-二甲基苯胺標準工作曲線，用外標法定量計算。對比用純溶劑直接配制的2，4-二甲基苯胺標準曲線，省去換算2，4-二甲基苯胺與雙甲脒分子量之間的轉換系數，還可消除水解萃取過程其回收率損失，使加標回收更合理、有效反映測定的準確性，確保分析結果穩定、可靠。

3.2 結論

已報道的文獻資料方法對食品中雙甲脒及其代謝物單甲脒的測定主要分兩類：一類是不經水解，直接測定其樣品中雙甲脒或者雙甲脒和2，4-二甲基苯胺的含量，以雙甲脒計。此類方法未經水解轉化，又忽略其它水解產物的含量，會導致測定結果偏小。第二類是樣品經水解處理，再測定其水解終產物2，4-二甲基苯胺的含量，后換算成雙甲脒含量，以雙甲脒計。國標法［7-8］水解反應在強酸介質120℃水浴條件下回流2 h，卻有文獻報道的水解反應只于離心管內在60～70℃恒溫干燥箱中靜置 30～50 min進行［5-6，11］，很顯然這些文獻檢測方法的反應溫度、壓力、時間等設計不能滿足水解反應的條件要求，從而水解進行不完全，會造成測定含量偏小，測定不準確。本文引入用微波消解罐于高溫高壓方式替代繁瑣的水浴回流方式進行水解反應，應用于雙甲脒及其代謝物的測定，提高水解反應速率、操作簡便、經濟高效。

綜上所述，本文用GC-MS/MS法對果蔬中雙甲脒及其代謝物殘留量的測定進行研究和優化，建立了用消解罐法進行雙甲脒水解反應的前處理方法，果蔬中雙甲脒在微波消解罐中酸催化水解得2，4-二甲基苯胺，經過量堿液中和堿化，正己烷液液萃取，以外標法定量計算得雙甲脒總殘留量。本方法的線性關系良好，靈敏度、精密度、回收率等均能滿足果蔬樣品農殘的檢測要求，并簡化前處理流程，為快速、準確、批量的進行果蔬樣品中雙甲脒總殘留量的檢測工作提供了參考。