基于尿pH 研究麻黃對(duì)高尿酸血癥模型大鼠血尿酸的影響

應(yīng)帥兵 黃繼勇

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是以血尿酸（serum uric acid，SUA）水平升高為特征的代謝性疾病，是痛風(fēng)、高血壓、高血脂、糖尿病和代謝綜合征等病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-2]。常用藥物別嘌醇、非布司他、苯溴馬隆等控制尿酸水平不僅存在長(zhǎng)期用藥的管理問題，更有皮膚黏膜、消化系統(tǒng)、肝腎功能損害等嚴(yán)重的不良反應(yīng)[3]。中藥穿山龍、車前草等均有降尿酸作用，但其降尿酸水平有限[4-5]。麻黃辛溫解表，具有宣肺利水功效。黃柏善清下焦?jié)駸幔哂袨a腎功效。本研究通過灌胃次黃嘌呤（hypoxanthine，HX）和腹腔注射氧嗪酸鉀（oteracil potassium，OP）聯(lián)合法建立HUA 模型，并予麻黃、黃柏水煎液干預(yù)，與別嘌醇進(jìn)行比較，以尿pH 和腎功能變化為切入點(diǎn)，評(píng)估麻黃及黃柏降尿酸的效果及其機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 健康雄性SD 大鼠30 只，5 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自上海斯萊克有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，合格證號(hào)：0345203，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012，飼養(yǎng)環(huán)境：全封閉隔離飼養(yǎng)，溫度范圍20℃～25℃，相對(duì)濕度范圍40%～60%，每天光照12h。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)要求（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理審查決議編號(hào)：ZSLL-2018-036）。

1.2 主要藥品與試劑 次黃嘌呤（Amresco 公司，批號(hào)20180121），氧嗪酸鉀（Sigma 公司，批號(hào)S27869-095），麻黃和黃柏（浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，批號(hào)20180310），別嘌醇片（重慶科瑞制藥，批號(hào)H50020455，規(guī)格：0.1g/片），尿酸測(cè)定試劑盒、肌酐測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20180314、20180321）；

1.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀；pH 計(jì)；日立7020 全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司產(chǎn)品）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物混懸液配置 HX 混懸液：HX 溶于3%可溶性淀粉溶液配置成25mg/mL 混懸液，OP 混懸液：OP 溶于生理鹽水配置成80mg/mL 混懸液；別嘌醇片混懸液：取別嘌醇片溶于無(wú)菌蒸餾水配置成1mg/mL；中藥水煎液：取麻黃、黃柏各100g，麻黃水煎液濃縮至2g/mL，使用時(shí)蒸餾水稀釋至0.05g/mL，黃柏水煎液濃縮至0.1g/mL，使用時(shí)用蒸餾水稀釋至0.1g/mL。置冰箱內(nèi)保存。

2.2 模型制備及處理 大鼠適應(yīng)性養(yǎng)殖1 周后按隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、麻黃組（0.5g/kg）、黃柏組（1.0g/kg）、別嘌醇組（200mg/kg），每組6 只。所有大鼠均予基礎(chǔ)飼料，自由采食飲水。除正常組外，其余各組大鼠選用尿酸前體物質(zhì)HX 和尿酸酶抑制劑OP 聯(lián)合建立HUA 模型[6]，每間隔24h 灌服HX 500mg·kg-1·d-1，腹腔注射OP 200mg·kg-1·d-1，連續(xù)灌胃1 周后建立HUA 模型。模型標(biāo)準(zhǔn)：（1）精神狀態(tài)：精神不振，閉眼發(fā)呆；（2）外形：皮毛松亂、脫落，無(wú)光澤，皮膚灰污；（3）SUA：造模第7 天，給藥6h 后內(nèi)眥靜脈采血，3500r/min 離心15min，取血清測(cè)定SUA，與正常組比較SUA 水平檢驗(yàn)造模成功與否[7]。造模成功后，除正常組外各組繼續(xù)灌胃HX 和腹腔注射OP，以60kg 體質(zhì)量成人用量麻黃6g，黃柏12g 換算大鼠生藥給藥劑量分別為0.5g·kg-1·d-1和1.0g·kg-1·d-1，別嘌醇給藥劑量為200mg·kg-1·d-1。按20mL/kg 灌胃量配置不同濃度的藥物：別嘌醇組2mg/mL；麻黃組濃度0.05g/mL，黃柏組0.1g/mL；同時(shí)正常組和模型組予以20mL·kg-1·d-1蒸餾水灌胃。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，給藥時(shí)間1 周，每天固定時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行灌胃操作，期間所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) （1）一般情況：每天觀察各組大鼠毛色、體質(zhì)量（body weight，BW）、飲食、體態(tài)、靈敏度和精神狀況；（2）肝臟指數(shù)（liver index，LI）、腎臟指數(shù)（kidney index，KI）：禁食24h 后稱重，在10%水合氯醛按0.3mL/100g 體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)行腹腔注射麻醉，解剖腹腔分離大鼠左側(cè)腎臟，于腎門處剪斷腎蒂，快速剝離腎臟包膜后以濾紙吸干并稱重，計(jì)算KI；分離大鼠肝臟，濾紙吸干稱重，計(jì)算LI。KI=[腎臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）]×100%，LI=[肝臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）]×100%；（3）生化指標(biāo)SUA 和SCr 檢測(cè)：經(jīng)腹主動(dòng)脈收集血液標(biāo)本，離心取血清，酶比色法SUA 測(cè)定，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行；肌氨酸氧化酶法測(cè)定SCr，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行；（4）尿量和尿液pH：處死前24h 將大鼠放入代謝籠，禁食收集尿液，離心取上清液用pH 計(jì)測(cè)定尿pH。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布及滿足方差齊性的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），不符合條件數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況、BW、KI 及LI 比較 正常組大鼠精神狀態(tài)良好、毛色光澤、尿量正常，糞便成麥粒狀，模型組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間均表現(xiàn)出精神萎靡、毛發(fā)無(wú)光澤易脫落、多尿、便稀等癥狀，治療組有類似表現(xiàn)。造模前各組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2 周后，與正常組比較，各組大鼠BW 增長(zhǎng)緩慢。與正常組比較，模型組和別嘌醇組大鼠KI 較大（P＜0.05），麻黃組和黃柏組大鼠KI 明顯偏大（P＜0.01）。與模型組比較，麻黃組大鼠KI 較大（P＜0.05），黃柏組和別嘌醇組大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠LI 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BW，KI 及LI 比較（%

表1 各組大鼠BW，KI 及LI 比較（%

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；BW：體質(zhì)量；KI：腎臟指數(shù)；LI：肝臟指數(shù)

組別正常組模型組別嘌醇組麻黃組黃柏組鼠數(shù)6 6 6 6 6 BW（g）222.50±6.89 198.67±17.2△△205.33±10.23△196.67±15.06△△204.67±5.65△KI 0.90±0.05 1.10±0.07△1.07±0.04△1.28±0.17△△*1.18±0.14△△LI 3.27±0.12 3.28±0.28 3.23±0.14 3.30±0.33 3.24±0.30

3.2 各組大鼠SUA 和SCr 水平比較 與正常組大鼠比較，模型組大鼠SUA 水平明顯升高（P＜0.01)，別嘌醇組、麻黃組和黃柏組大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組大鼠比較，別嘌醇組、麻黃組及黃柏組大鼠SUA 水平明顯降低，麻黃組大鼠降尿酸效果與別嘌醇組、黃柏組大鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠SCr 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠SUA 和SCr 水平比較（

表2 各組大鼠SUA 和SCr 水平比較（

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；SUA：血清尿酸；SCr 血清肌酐

組別正常組模型組別嘌醇組麻黃組黃柏組鼠數(shù)6 6 6 6 6 SUA（mmol/L）40.66±16.77 77.96±19.40△△46.89±9.90**42.05±8.23**51.13±13.86**SCr（μmol/L）59.41±28.00 75.61±7.07 65.76±9.85 70.75±6.81 88.00±10.90

3.3 各組大鼠尿量和尿pH 比較 各組代謝籠收集24h 尿液外觀與氣味比較無(wú)明顯差別。與正常組比較，各組大鼠尿量均明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，各組大鼠尿量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)pH計(jì)測(cè)定各組大鼠尿pH：與正常組比較，別嘌醇組和黃柏組大鼠尿pH 增加呈堿性（P＜0.05），麻黃組大鼠尿pH 增加顯著（P＜0.01）。與模型組比較，麻黃組大鼠尿pH 較高（P＜0.05），其余各組大鼠尿pH 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠尿量和尿pH 水平比較

表3 各組大鼠尿量和尿pH 水平比較

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

組別正常組模型組別嘌醇組麻黃組黃柏組鼠數(shù)6 6 6 6 6尿量（mL）7.00±2.30 29.50±5.25△△31.17±15.37△△26.83±15.13△△34.33±4.27△△尿pH 值6.52±0.92 6.82±0.40 7.55±0.83△7.67±0.58△△*7.63±0.73△

4 討 論

HUA 病機(jī)與高脂血癥、代謝綜合征相似，多為痰濁所致，與水液代謝失常有關(guān)。HUA 治法以祛邪通絡(luò)為主，用藥貴在宣通疏泄。臨床上使用麻黃連翹赤小豆湯治療HUA[8]。麻黃生物堿（如：LEP、DPEP、LMEP）是君藥麻黃發(fā)揮治療效果的必需活性成分[9]。藥理研究表明，麻黃堿和偽麻黃堿通過降低IL-21 水平減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷，通過改善胰島素抵抗，代謝綜合征等途徑發(fā)揮降血糖、降血脂和抗氧化作用[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單味麻黃可以通過堿化尿液發(fā)揮降低HUA 大鼠SUA 水平的作用，且效果與別嘌醇和黃柏差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)麻黃用量選取臨床常用劑量6g，探究不同濃度麻黃對(duì)尿酸的效果具有巨大潛力。

中藥治療HUA 的機(jī)制多從黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（uric acid transporters，URAT1）入手，如土茯苓根莖，虎杖，川芎和姜黃抑制XO 的活性減少尿酸生成，而山藥，梔子和草本植物通過調(diào)節(jié)URAT1 的表達(dá)影響尿酸的重吸收[5，12-18]。臨床使用碳酸氫鈉和枸櫞酸鈉藥物調(diào)節(jié)尿pH 而增加尿酸溶解，進(jìn)而抑制尿酸重吸收，但過度堿化可導(dǎo)致磷酸鈣、碳酸鈣等結(jié)石形成，因此調(diào)節(jié)尿pH 在適當(dāng)范圍內(nèi)對(duì)于增加尿酸排泄和預(yù)防尿酸性腎結(jié)石具有重要意義。已有研究表明，黃柏可以降低SUA 水平，其機(jī)制與抑制URAT1 和其mRNA 表達(dá)水平，抑制小鼠肝臟XO 活性相關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃柏降尿酸的效果與既往研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，黃柏組尿pH 與模型組無(wú)顯著差異，麻黃組尿pH 大于模型組，說(shuō)明藥物影響尿酸代謝與堿化尿液有關(guān)，而尿液pH 范圍與增加尿酸排泄的關(guān)系需進(jìn)一步研究。

SUA 升高同樣可引起腎臟病變，持續(xù)尿酸鈉晶體沉積于腎小管—間質(zhì)可引起尿酸性腎病[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除正常組外各組均有不同程度的腎臟肉眼改變，腎臟表面出現(xiàn)邊界清楚，形狀不規(guī)則的白色斑塊，與正常組比較各組KI 升高，因此藥物干預(yù)對(duì)于腎臟病變有一定的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麻黃可以顯著降低SUA 水平，且作用效果較別嘌醇與黃柏?zé)o顯著差異，其機(jī)制可能與堿化尿液有關(guān)。