新皮質的微小損傷對阿爾茨海默病模型小鼠學習能力的影響

鄒敬宇，班允超，徐曉鶴，包義君，吳安華

（中國醫科大學 1. 附屬第一醫院神經外科，沈陽 110001； 2. 附屬盛京醫院眼科，沈陽 110004）

阿爾茨海默病 （Alzheimer disease，AD） 是一種進行性發展的神經系統退行性疾病［1］，占癡呆病例的60%～70%［2］，目前公認的病理生理特征為淀粉樣蛋白的沉積和神經纖維纏結及神經細胞凋亡［3］。然而，認知能力與斑塊的積累并非總是密切相關［4］。無論是AD患者還是AD模型小鼠，在淀粉樣蛋白斑塊出現之前，通常就已經出現了學習能力的損害［5］。越來越多的研究［6］表明，在形成淀粉樣沉積前，可溶性的β-淀粉樣蛋白 （amyloid β-protein，Aβ） 在AD的病理進程中發揮著重要作用，尤其是AD早期階段。腦外傷 （traumatic brain injury，TBI） 是導致AD的危險因素［7］，并且可以加速AD的病理進程，降低AD的發病年齡［8］。有研究［9］表明，TBI或運動相關的腦損傷可加速AD樣神經病理學的改變。與無損傷的大腦相比，受損的大腦內不溶性Aβ沉積物更多。在3xTg-AD模型小鼠中，TBI小鼠提前出現了AD樣病理學的改變［10］。而TBI是否可導致可溶性Aβ增加，從而導致行為學改變以及突觸和神經元功能受損，尚無報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組：20只C57BL/6雄性小鼠（WT），20只三轉基因APP/PS1/tau雄性小鼠 （3xTg） ，4～5月齡，由日本金澤醫科大學生理學Ⅰ實驗室惠贈。各隨機分為2組 （n = 10） ，分別標記為WT組和3xTg組。距前囟和頂枕點連線中點左右兩側2.0 mm處，用直徑為0.6 mm的電鉆鉆開顱骨，使用漢密爾頓1 μL注射器，在雙側皮質表面以下1.0 mm處注入0.25 μmol/L谷氨酸鈉 （glutamate，Glu） 或生理鹽水0.2 μL。

1.1.2 主要試劑及儀器：Glu，Morris水迷宮及視頻軟件，震蕩切片機，玻璃電極控制儀，恒流泵，恒溫浴槽，電子天平，生理信號采集記錄分析系統。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮實驗：本研究采用經典Morris水迷宮實驗方法［11］。應用圓形恒溫水池 （直徑150 cm，高50 cm） ，水溫 （25±1） ℃；在第2象限正中放置直徑9 cm、低于水面1 cm的圓形平臺，距離水池邊緣約30 cm，各象限的池壁中點處上方分別放置紅、綠、藍、黃色的模型作為小鼠尋找平臺的參照物。實驗期間，保持圓形平臺和4個參照物的位置不變。

連續5 d進行定位航行實驗，每日下午1次，在4個象限中點處作為入水點，將小鼠面向池壁置入水中，記錄1 min內找到平臺的時間，如1 min內小鼠仍未找到平臺，則將小鼠人為放置于平臺，停留1 min。每次入水實驗間隔休息30 s，將小鼠拭干。在第5天實驗結束后撤去平臺，設置同樣的參數進行空間探索實驗，任選一處入水，測量小鼠穿越平臺所在位置的次數，停留時間及游動距離。尾靜脈注射，7 d后再進行Morris水迷宮實驗。第1組小鼠完成注射2周后行Morris水迷宮實驗。另一組小鼠在Morris水迷宮實驗后進行注射，2周后進行第2次水迷宮實驗。

1.2.2 小鼠海馬腦片細胞外記錄場興奮性突觸后電 位 （field exciatatory postsynaptic potential，fEPSP）：配置好使用的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF） 和切片液，裝有切片的燒杯至于冰水混合物中，小鼠斷頭取腦，置入切片液中5 min，取出腦組織，分離海馬及相連皮質，用低濃度瓊脂將組織固定于備好的瓊脂塊膠皿中，切片液倒入膠皿，將膠皿固定在振動切片機，腦片厚度400 μm，將切好的腦片置入ACSF中，所有操作均通氧氣。使用恒流泵建立有氧的ACSF循環。腦片轉至記錄槽固定，刺激電極置于CA3區錐體細胞schaffer側支，記錄電極（充以1 mol/L NaCl玻璃微電極） 置于CA1區錐體細胞樹突層130～200 μm。設置參數，刺激電壓為引起最大fEPSP的30%，基礎fEPSP穩定30 min，穩定后記錄5 min，改為TBS參數，TBS后改為原參數記錄fEPSP，如PS增幅＞20%，持續30 min，視為LTP誘發成功。

1.3 可溶性Aβ1-42的測定

斷頭取腦，液氮凍存游離的海馬組織，按腦質量加入相當體積的生理鹽水，用勻漿器將組織研磨，在冰浴下超聲波粉碎制成勻漿，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。上清液用1 mol/L Tris稀釋20倍，中和PH。采用BNT-77/BC-05夾心酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書 （日本Wako Chemical Ltd公司）進行操作。建立標準曲線：試劑盒標準溶液 （人Aβ1-42） 20 pmol/L，然后獲得每個腦組織的Aβ1-42的濃度（pmol·L-1·g-1） 。對于每個樣品，重復測量2次。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行方差分析和t檢驗，計量資料采用表示，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試

與3xTg小鼠相比，WT小鼠逃避潛伏期顯著縮短 （P ＜ 0.01，表1） ，將WT和3xTg小鼠每組再分為平均成績幾乎相同的2組，分別注射谷氨酸鈉 （WT+G組和3xTg +G組） 和生理鹽水 （WT+S組和3xTg +S組） 。與3xTg+S組小鼠相比，3xTg+G組小鼠逃避潛伏期顯著增加 （P ＜ 0.05，表2） ，3xTg+G組小鼠 1 min內在平臺所在象限停留時間比例（40.64%±1.36%） 顯著低于3xTg+S組小鼠 （48.56%±1.63%） （P ＜ 0.05，n = 10） 。而WT+S組小鼠與WT+G組小鼠的逃避潛伏期無統計學差異 （P ＞ 0.05，表2） ；WT+S組小鼠（53.74%±1.24%） 與WT+G組小鼠 （51.58%±1.46%）1 min內在平臺所在象限停留時間比例無統計學差異 （P ＞ 0.05，n = 10） 。

2.2 各組海馬fEPSP斜率

表1 各組小鼠逃避潛伏期 （ ，n = 10）Tab.1 Escape latency of mice in each group （ ，n = 10）

表1 各組小鼠逃避潛伏期 （ ，n = 10）Tab.1 Escape latency of mice in each group （ ，n = 10）

Compared with 3xTg mice，1） P ＜ 0.05；2） P ＜ 0.01.

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表2 Glu對各組小鼠逃避潛伏期的影響 （，n = 10）Tab.2 Effect of glutamate on escape latency of mice in each group （，n = 10）

表2 Glu對各組小鼠逃避潛伏期的影響 （，n = 10）Tab.2 Effect of glutamate on escape latency of mice in each group （，n = 10）

Compared with 3xTg+G group，1） P ＜ 0.05.

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各組高頻強直刺激后成功誘發LTP，持續記錄30 min。3xTg+S組小鼠fEPSP斜率明顯高于3xTg+G組小鼠，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。WT+G組小鼠與WT+S組小鼠fEPSP相比，斜率無統計學差異 （P＞ 0.05） ，見圖1。

圖1 各組小鼠高頻強直電刺激前后海馬CA1區fEPSP相對最大斜率的比較

2.3 DNA微陣列分析

從每組隨機選出3只小鼠并取出雙側海馬，進行DNA微陣列分析。注射生理鹽水的組與注射Glu的組相比，有3個基因的表達增加了2倍以上 （P ＜ 0.05，n = 3） ，1個基因下調2倍以上 （P ＜ 0.05，n = 3） 。見表3。

2.4 海馬組織內可溶性Aβ1-42測定

為了驗證Glu可能導致海馬內Aβ1-42增加，從而導致3xTg小鼠的學習能力惡化，用酶聯免疫吸附實驗比較了3xTg+G組小鼠和3xTg+S組小鼠海馬可溶性Aβ1-42含量。結果表明，3xTg+G組 （6.037 pmol·L-1·g-1） 海馬內可溶性Aβ1-42顯著高于3xTg+S組 （4.327 pmol·L-1·g-1，t = 2.776，P = 0.020） 。

3 討論

已有研究［12］顯示，TBI可加速Aβ斑塊的沉積，從而加速其認知功能的損害，然而，TBI是否在早期即引起可溶性Aβ增加，從而引起認知功能的損害，目前尚無報道［13］。因此，近來越來越多的學者將目光集中到了AD早期細胞內可溶性Aβ的相關研究。

本研究以4～5月齡的3xTg-AD模型小鼠為研究對象，該月齡小鼠特點為可溶性Aβ已在細胞內聚集，而細胞外Aβ斑塊尚未沉積。結果表明，Glu誘導的微小皮質損傷能夠損害3xTg-AD模型小鼠空間學習能力。

通過1次傳統的Morris水迷宮實驗，將3xTg小鼠分為成績相同的2組，同時將WT小鼠也分為成績相同的2組，分別進行Glu損傷注射和生理鹽水對照注射，而后進行重復的Morris實驗表明，3xTg+S組的學習記憶能力明顯優于3xTg+G組。而WT+S組與WT+G組無統計學差異。

表3 各組小鼠海馬組織DNA微陣列分析結果 （n = 3）Tab.3 Results of DNA microarray analysis in hippocampi of mice in each group （n = 3）

為了驗證Glu誘導3xTg小鼠學習能力惡化的原因，用酶聯免疫吸附實驗對比了3xTg+G組和3xTg+S組小鼠海馬組織中可溶性Aβ1-42含量，結果表明，3xTg+G組學習能力的下降可能與海馬組織中可溶性Aβ1-42含量的增加有關。

本研究中，海馬并未直接受到注射損傷，故推斷注射損傷可能產生了某些因子并傳遞到海馬組織，而Glu引起海馬內可溶性Aβ1-42含量增高，可能也由這些因子造成，因此本研究進行了DNA微陣列分析。結果表明，與生理鹽水對照組相比，Glu注射組海馬組織的Prg4，4833420G17Rik，Arhgef10基因表達增加了2倍以上 （P ＜ 0.05） ，Upk1b基因表達下降了2倍以上 （P ＜ 0.05） ，但它們是否與Aβ的增殖和清除存在直接關聯目前尚無報道。因此，這些“可移動的”因子還有待進一步研究。

顱腦損傷與AD的相互作用還存在很多未知因素，微小顱腦損傷可能加快AD臨床前期的發展速度。神經細胞凋亡可上調皮質中某種因子的表達，該因子通過某種途徑轉運至海馬組織中，激活Aβ42產生的循環通路，啟動小鼠認知功能障礙。未來將通過體內外實驗進一步研究皮質神經細胞凋亡—某因子—Aβ42—小鼠認知功能障礙之間的內在機制。