秸稈生物質炭對根際土壤細菌-真菌群落分子生態網絡的影響*

馬泊泊 黃瑞林 張 娜 孫 波 梁玉婷?

（1 常州大學環境與安全工程學院，江蘇常州 213164）（2 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008）

根際是土壤中植物根系受到微生物特殊影響的重要區域，該區域從主根表面延伸幾毫米，是植物-土壤-微生物相互聯系的重要場所［1-2］。根際環境中，細菌與真菌密切聯系，細菌以真菌的菌絲為通道進入土壤基質。腐生真菌依靠分泌的胞外酶分解利用有機質，附著在其菌絲上的細菌也可從這個過程中獲取養分，從而抑制真菌的生長。細菌還可以與真菌合作，通過降解抑制真菌生長的有毒化合物或多糖，或通過固氮為真菌降解木質纖維素提供氮進而加快有機質的分解速率［3］。細菌和真菌的相互作用在生態系統的養分循環過程中起著關鍵作用，對植物的健康生長有重要影響［4］。Toro等［5］研究植物利用低生物有效性磷源時發現，雙重接種叢枝菌根真菌和具有溶磷能力的枯草芽孢桿菌可顯著增加作物的生物量和氮、磷積累量，證明根際促生細菌和菌根真菌之間的相互作用促進了營養元素的持續供應。根瘤菌和菌根真菌的互作可顯著緩解半寄生植物對宿主的寄生危害［6］，此外，生活在根際環境中的木霉、芽孢桿菌等可以通過與真菌病原體產生拮抗作用，減少病原微生物的傳播，降低植物病害水平［7-8］。生態網絡分析法（Ecological network analysis）可以將微生物群落的相互作用關系可視化，并揭示物種在微生境中的共現關系及主要影響因素［9］，為解釋復雜的微生物群落結構提供了一種新的方式。利用網絡分析法可以揭示土壤重要元素生物地球化學耦合過程中微生物的互作機制，是預測和改善土壤生態系統服務功能的重要步驟［3］。已有報道利用網絡分析法探討土壤中細菌-真菌的相互作用關系，例如，Purahong等［10］使用網絡分析法研究了凋落物分解過程中細菌和真菌群落的交互作用模式，證明凋落物分解的不同階段是由細菌、真菌群落的變化和相互作用控制的。

生物質炭作為改良劑是目前改善土壤肥力和固碳減排的有效方法之一［11-13］。生物質炭以其特殊的結構和組成，可以改善土壤的許多特性，如促進團聚體的形成、增加陽離子交換量、增強養分吸收能力和持水能力以及減緩過量酸化等［14-16］，在土壤改良和農作物增產等方面有良好的應用［17-18］。此外，生物質炭本身特有的芳香化表面、良好的多孔性結構以及極高的水肥吸附作用還可以為土壤微生物如細菌和真菌提供棲息地，增加微生物的生物量［19］。大量的研究證實，添加生物質炭可以改變微生物的群落結構和酶活性，這對于有機質積累、養分轉化等土壤生態過程有著重要作用［20-23］，從而間接影響植物的生長［24-26］。盡管生物質炭對土壤微生物的影響受到越來越多的關注，但是關于生物質炭對微生物群落生態網絡的研究存在不足，尤其是對于生物質炭是如何影響根際土壤細菌-真菌群落相互作用的方面，仍缺乏相關研究。

水稻是世界主要糧食作物之一，種植廣泛，研究水稻土具有重要的實用意義；黑麥草是優質的放牧用牧草，作為主要的綠肥有一定的研究基礎。本研究選擇水稻土和黑麥草作為試驗材料，通過對16S rRNA（V4-V5區）和ITS2區的高通量測序，利用生態網絡分析法構建施加生物質炭處理和未施加生物質炭的條件下黑麥草根際細菌-真菌群落互作網絡，進一步揭示秸稈生物質炭對根際土壤細菌-真菌群落相互作用的影響及主要驅動因素，探討生物質炭對根際土壤細菌-真菌群落互作模式的改變及主要機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤為黃棕壤，于2016年11月份采自中國江蘇省常州市（119.75°E，31.73°N），采集水稻田0～10 cm土壤（非淹水條件下），風干后過2 cm篩并研磨粉碎備用。土壤的理化性質：比表面積28.73 m2·g-1，微孔面積4.57 m2·g-1，外表面積24.17 m2·g-1，微孔體積0.002 cm3·g-1；pH7.65，銨態氮含量1.24 mg·kg-1，硝態氮含量0.28 mg·kg-1，有效磷含量0.34 mg·kg-1。

供試黑麥草種子來自中國江蘇省農業科學院牧草研究所。生物質炭樣品由小麥秸稈在600 ℃缺氧條件下緩慢熱解8 h而成。

1.2 研究方法

試驗為盆栽試驗，設置添加生物質炭（生物質炭按2%的比例均勻添加到盆栽土壤中）和對照（未施加生物質炭）兩組處理。每盆裝土3 kg，種入30粒飽滿的黑麥草種子，在種苗發芽后的第0、5、10、15、20、25、30、35、40天進行破壞性采樣，3個重復，共計54盆。

采樣時，將黑麥草從盆栽中取出，用抖落法將每盆土壤的根際土壤收集好并按要求保存，用于土壤理化性質和根際微生物的測定（若土樣量無法達到測試要求，使用小型鐵鍬刮取根系周圍＜ 1 cm范圍的土壤）。對應的黑麥草植株用于測定根系體表形態學參數。

土壤的p H、銨態氮、硝態氮和有效磷的測定參考文獻［27］。土壤物理結構的測定：利用TriStar II 3020全自動比表面積及孔隙度分析儀對各樣品做氮氣吸附、解吸試驗，氮吸附在液氮溫度（77 K）下操作。分析測試前，樣品在150 ℃條件下真空（約10-2Pa）脫氣4 h，然后利用BET法［28］計算出樣品的比表面積（SBET），利用t-plot模型［29］計算微孔比表面積（Smi）和孔體積（Vmi）。植物根系的測定：將洗凈的根放入根盤內，根據植物根系測定方法［30］，使用掃描儀( V700 Epson) 掃描完整的根系圖像存入計算機，采用WinRHIZO PRO 2007根系分析系統軟件分析根系總長度、平均直徑、平均長度、總表面積、總切面面積、平均表面積、平均切面面積等形態學參數。

1.3 DNA提取及高通量測序

稱取2 g土壤樣品，加入液氮冷凍研磨，使用Power Soil DNA isolation kit提取土壤總DNA。提取后上機檢測各樣品DNA的質量和濃度，合格的樣品在-80℃條件下保存。利用Illumina測序平臺，對54個樣本做細菌16S rRNA（V4-V5區）和真菌（ITS2區）高通量測序，以標準的細菌/真菌基因組DNA Mix作為陽性對照，根據選定的檢測區域確定相對應的擴增引物，對各樣本的檢測區域做高保真PCR擴增。細菌16S rRNA（V4-V5區）擴增引物序列為：Primer F=Illumina adapter sequence 1 + GTGCCAGCMGCCGCGG，P r i m e r R=I l l u m i n a a d a p t e r s e q u e n c e 2 +CCGTCAATTCMTTTRAGTTT；真菌（ITS2區）擴增引物序列為：Primer F = Illumina adapter sequence 1+GCATCGATGAAGAACGCAGC，P r i m e r R=I l l u m i n a a d a p t e r s e q u e n c e 2+TCCTCCGCTTATTGATATGC。細菌16S rRNA（V4-V5區）區域擴增的PCR條件為：預變性步驟設置95 ℃、2 min；變性步驟設置94 ℃、20 s，退火步驟設置55 ℃、40 s，延伸步驟設置72 ℃、1 min，重復循環變性-退火-延伸三個步驟35次；末延伸步驟設置72 ℃、2 min。真菌（ITS2區）區域擴增的PCR條件為：預變性步驟設置94 ℃、2 min；變性步驟設置94 ℃、30 s，退火步驟設置55 ℃、30 s，延伸步驟設置72 ℃、1 min，重復循環變性-退火-延伸三個步驟25次；末延伸步驟設置72 ℃、10 min。利用帶有Index序列的引物，通過高保真PCR將特定的標簽序列導入文庫末端。細菌樣本添加特異性標簽序列的PCR條件為：預變性步驟設置98 ℃、30 s；變性步驟設置98 ℃、10 s，退火步驟設置65 ℃、30 s，延伸步驟設置72 ℃、3 0 s，重復循環變性—退火—延伸三個步驟11次；末延伸步驟設置72℃、5 min。真菌樣本添加特異性標簽序列的PCR條件為：預變性步驟設置94 ℃、2 min；變性步驟設置94 ℃、30 s，退火步驟設置55 ℃、30 s，延伸步驟設置72 ℃、1 min，重復循環變性-退火-延伸三個步驟8次；末延伸步驟設置72 ℃、10 min。應用核酸純化磁珠純化擴增產物，得到樣本的原始文庫。利用Qubit熒光定量儀對文庫精確定量，按相應比例（摩爾比）混合樣本。通過Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀檢測混樣后的文庫插入片段的大小，確認在120～200 bp之間無非特異性擴增，并準確定量測序文庫濃度。采用Miseq系列測序儀2×250 bp的雙端測序策略對文庫做測序。

原始下機數據經過質量控制和過濾后，利用U PA R S E 軟件對其做O T U（O p e r a t i o n a l Taxonomic Unit）聚類分析，分類依據參照RDP（RibosomalDatabase Project）數據庫的RDP Release 11.5版本。細菌測序中每個樣本獲得的序列數范圍為42 534～76 867 reads，為了盡量減少樣本中讀取計數變化的影響，我們基于樣本序列最低數量（42 534 reads）對其做抽平化處理，按照97%的相似性對所有序列做OTU劃分，各樣品文庫的覆蓋率均達到98%以上。真菌測序中每個樣本獲得的序列數范圍為44 941～98 438 reads，同樣基于樣本序列最低數量（44 941 reads）對其做抽平化處理，使各樣品文庫的覆蓋率均達到98%以上，保證樣本中絕大多數序列均可被測出，因此本次測序結果可以代表樣本的真實情況。

1.4 數據分析

根據Illumina測序得到的細菌和真菌的OTU數據，使用Cytoscape（3.5.0）軟件中的CoNet插件構建微生物生態網絡。分析步驟和網絡參數的選擇參照顧靜馨［31］提供的操作方法，網絡分析中，我們選擇四種相關分析方法，即Pearson correlation，Spearman correlation，Bray-Curtis dissimilarity和Kullback-Leibler dissimilarity，并設置700的起始連接數。然后，采用Benjamini-Hochberg方法標準化處理相關系數，即校正原有假設檢驗得到的顯著性P值（P-value），并最終采用校正后的P值，保留P＜0.05的相關OTU構建關聯網絡。利用NetworkAnalyzer工具，獲得網絡的特征路徑長度、連接數、節點數、聚集系數、網絡密度和平均連通度等網絡拓撲參數。

根據中介中心性值（betweenness centrality scores）指標的最大值確定關鍵物種［32-33］，中介中心性指的是一個節點擔任其他兩個節點之間最短路徑的橋梁的次數。網絡中任意兩個節點的所有最短路徑，如果這些最短路徑中有很多條都經過了某個節點，那么就認為這個節點的中介中心性高。一個節點充當“中介”的次數越高，它的中介中心度就越大，說明節點在網絡中承擔的角色越重要。節點的中介中心值可由互作網絡導出。

分子復合物檢測（MCODE）是一種基于網絡密度的網絡模塊識別算法，首先根據節點所在的、最高K-core值的密度為網絡中的所有節點賦予一個權值，并選取具有最高權值的一個節點視作種子節點，依次向外擴增，將權值在閾值之上的周邊節點依次納入到模塊中，直至沒有節點可包含到該模塊中為止。然后將選擇剩余下來的節點中權值最高的視作種子節點做同樣的操作。最后根據設定的K-core值將不滿足條件的模塊刪除。使用Cytoscape（3.5.0）軟件中的MCODE插件分析互作網絡中高度互連節點的模塊化結構和組，所有分析參數均采用標準值，即度數截止值設為2，節點得分截止值設為0.2，K-core值設為2，種子最大深度設為100。使用Mantel test分析方法評估土壤結構、環境因子以及植物根系等因子對根際土壤細菌-真菌群落相互作用的影響，Mantel test在微生物領域常被用于計算物種組成和環境因子之間的相關性，基于Pearson相關性分析以及置換檢驗計算統計學顯著性P值，分析在R-studio v7.2中利用ecodist軟件包實現。

2 結 果

2.1 施加生物質炭對微生物互作網絡結構的影響

基于顯著相關性對細菌和真菌的高通量測序數據構建互作網絡（圖1），探究施加生物質炭處理下根際土壤細菌-真菌群落的共現模式，使用NetworkAnalyzer工具計算網絡的拓撲參數（表1）?？梢钥闯?，施加生物質炭對根際土壤細菌-真菌群落之間的共現模式產生重要影響，網絡拓撲性質的分析表明，網絡節點數、連接數、聚集系數、特征路徑長度、網絡密度和平均連通度等網絡拓撲參數在對照組和生物質炭組之間顯著不同（P＜0.05）。對照組中，根際土壤細菌-真菌群落的互作網絡包含44個節點（其中細菌節點數為24，真菌節點數為20）、112條連線（其中28.6%為正連線，71.4%為負連線）；生物質炭組中，根際土壤細菌-真菌群落的互作網絡包含84個節點（其中細菌節點數為62，真菌節點數為22）、455條連線（其中51.6%為正連線，48.4%為負連線）。施加生物質炭后，網絡的節點數增多，且主要表現為細菌節點數的增多，網絡的連接數增多，正連接數占總連接數的比重增加，施加生物質炭顯著增強了細菌-真菌互作網絡的積極聯系（P＜0.05）。與對照組相比，施加生物質炭處理條件下根際土壤細菌-真菌群落的互作網絡表現出更高的網絡密度、聚集系數和平均連通度。

圖1 兩種處理下細菌-真菌共現模式的響應網絡Fig. 1 Network of the bacterial and fungal co-occurrence pattern relative to treatment

表1 兩種處理下細菌-真菌互作網絡的拓撲性質Table 1 Topological parameters of the bacterial and fungal interaction network relative to treatment

圖2展示了互作網絡中群落之間連接數的分布情況。對照組中，細菌-真菌群落之間的相互作用（共60個相關中有7個正相關）居于主導地位，顯著高于細菌群落內部（共38個相關中有18個正相關）以及真菌群落內部（共14個相關中有7個正相關）的相互作用。施加生物質炭處理條件下，群落間相互作用加強，細菌群落內部相互作用（共311個相關中有195個正相關）增加得更為明顯，顯著高于細菌-真菌群落之間（共132個相關中有32個正相關）以及真菌群落內部（共12個相關中有8個正相關）的相互作用。施加生物質炭處理后，細菌群落內部以及細菌-真菌群落之間的積極聯系顯著增強（P＜0.05）。

圖2 兩種處理下互作網絡中相互作用的分布餅狀圖Fig. 2 Pie chart of the distribution of interactions in the interaction network relative to treatment

2.2 施加生物質炭對關鍵類群和網絡模塊化的改變

根據中介中心性值指標的最大值確定了關鍵物種。網絡分析的中介中心性指標顯示（圖1），對照組中介中心性指標的總體分布為0～0.27，其中起到關鍵連接作用的類群有細菌中的孫修勤菌（Sunxiuqinia）和真菌中的畢赤酵母（Pichia），中介中心性值分別為0.1 4 5 和0.1 6 4。生物質炭組中介中心性指標的總體分布為0 ～0.3 2，其中起到關鍵作用的類群為細菌中的黃桿菌（Flavobacterium），中介中心性值為0.131。

圖3 兩種處理下互作網絡MCODE分析的子網絡圖Fig. 3 Subnetwork diagram of the interaction network based on MCODE analysis relative to treatment

MCODE分析兩種處理下的互作網絡，均發現存在兩個具有高度互連節點的顯著聚類（圖3）。對照組中，得到的子網絡的網絡分數分別為3.5（節點數為9，連接數為14）和2.75（節點數為9，連接數為11），且均以細菌節點和負相互作用為主。生物質炭組中，得到的子網絡的網絡分數分別為12.4（節點數為16，連接數為93）和8.429（節點數為15，連接數為59），且均以正相互作用為主。關鍵類群中的畢赤酵母（Pichia）和黃桿菌（Flavobacterium）分別出現在對照和施加生物質炭處理的得分最高的模塊化結構中。

2.3 施加生物質炭對環境因素影響細菌-真菌群落相互作用的改變

利用Mantel test分析對照組和生物質炭組中植物根系（根系總長度、平均直徑、平均長度、總表面積、總切面面積、平均表面積和平均切面面積）、土壤物理結構（比表面積、微孔面積、外表面積和微孔體積）以及土壤環境因子（pH、銨態氮、硝態氮和有效磷）對根際土壤細菌-真菌之間相互作用（互作網絡中正連接數與總連接數的比值）的影響（表2）。在對照組中，物理結構（r=0.318，P=0.001）對細菌-真菌之間相互作用表現出顯著影響。施加生物質炭后，環境因子對細菌-真菌互作的影響顯著改變，土壤pH（r=0.385，P=0.003）和土壤銨態氮（r=0.501，P=0.0 0 3）對細菌-真菌互作的影響顯著增強。

3 討 論

3.1 生物質炭對共現模式的影響

本研究通過構建細菌-真菌群落的互作網絡（圖1），探討了施加生物質炭對根際土壤細菌-真菌共現模式的影響。研究結果發現，微生物共現模式在施加生物質炭后顯著改變（表1），相比于未施加生物質炭的對照組，施加生物質炭后細菌與真菌之間的相互作用顯著增多，互作網絡的節點顯著增多，網絡變得更加復雜，這與Gundale和DeLuca［34］的研究結果相照應——添加生物質炭可以通過改變理化性質（如pH和持水能力等）來提高土壤養分有效性。通常，我們認為生態系統中的有效養分越豐富，微生物生態網絡復雜性和穩定性也越高，群落的高穩定性是實現生態功能的重要因素［35］。此外，生物質炭的特殊孔隙結構對細菌和真菌有保護作用，能夠降低競爭者對它們的侵害。本研究中，Mantel test分析（表2）結果表明，施加生物質炭后，土壤pH（r=0.385，P = 0.003）和銨態氮（r=0.501，P=0.003）對細菌-真菌互作的影響顯著增強，與Lauber等［36］的pH是調節細菌群落結構的最重要參數，而真菌群落與營養狀況關系最為密切的假設一致，認為土壤酸度的改變有利于細菌的生長，而銨態氮的變化導致了真菌群落的改變，從而影響互作網絡。施加生物質炭還能夠促進黑麥草根系的生長，增加其生物量，同時，增強的根系產生的分泌物又可以為微生物的代謝和生長提供營養和能量，改變根際微生物與植物之間的聯系，從而改變根際土壤微生物的種類和數量。

對照組的互作網絡中，在細菌和真菌群落內部以及細菌和真菌之間的相互作用以負相關關系為主（圖2），表明細菌和真菌對資源存在著潛在的競爭［37］。但是，隨著生物質炭的施加，分子生態網絡改變，并且相互作用以正相關關系為主，尤其是細菌-真菌群落之間負相互作用的占比降低，這與Banerjee［38］的研究發現相似，添加有機物和營養物質后，細菌-真菌互作網絡的正相互作用增強，細菌、真菌模塊內部和細菌-真菌群落之間的負相關數量減少，這可能是因為生物質炭或者有機物及營養物質的添加豐富了群落的營養結構，緩解了競爭。

3.2 生物質炭對網絡模塊化結構的影響

土壤生態系統中，模塊化分析對于識別樣本之間的微生物關聯、提高其與非生物因素的相互作用的理解是非常重要的。MCODE分析兩種處理下的互作網絡，均發現存在兩個具有高度互連節點的顯著聚類，相比于對照組，施加生物質炭處理條件下互作網絡的模塊化結構更為復雜，具有更高的網絡分數和更多的節點及相互作用，且均以細菌節點居多。這些模塊并非嚴格遵循分類學分類，即微生物之間存在相互作用但不依賴于它們的分類，類似地，Burke等［39］對細菌群落組裝的研究發現，樣本間微生物物種的組成存在較大的差異，但其功能的相似性高達70%，證明了細菌群落的組裝是由功能基因而非物種分類決定的，并提出具有相似營養物質或其他生態特性的物種能夠占據相同的生態位的觀點。本研究中，生物質炭的添加重新分配了系統資源是導致模塊化模式改變的可能原因。

關鍵類群是微生物群落中高度連接的類群，具有特殊而重要的作用，它們的去除可引起群落結構和功能的急劇變化。Banerjee［38］研究證實土壤有機質分解率由關鍵類群（細菌中的酸桿菌門、弗拉特氏菌屬和芽單胞菌屬以及真菌中的毛殼菌屬和鐮刀菌屬等）的豐度決定，并且在此前的研究中，Li等［40］發現在有機質含量高的土壤中，芽單胞菌門和酸桿菌門具有較高的豐度，Harreither等［41］證實子囊菌門的毛殼菌屬在降解纖維素、纖維二糖和木質素等有機質方面起著關鍵作用，這不僅支持了關鍵類群對于特定生境和過程的重要性，而且為關鍵類群與微生物群落功能的相關性提供了證據。我們的研究發現，關鍵類群中的畢赤酵母（Pichia）和黃桿菌（Flavobacterium）分別出現在對照和施加生物質炭處理的得分最高的模塊化結構中，這可能說明關鍵類群在模塊化結構中同樣發揮重要的連接作用。

然而，這些共現模式是統計上確定的各種OTU的相對豐度之間的關聯，僅能指示潛在的正相互作用或負相互作用。在田間條件下，這些相互作用是否會發生在微觀尺度上需要進一步的有針對性的研究，并且未來將增加實驗來加強關于網絡的動態變化和機制的研究。

4 結 論

施加生物質炭顯著豐富了黑麥草根際土壤細菌-真菌群落的網絡相互作用，加強了細菌內部以及細菌與真菌之間的積極聯系。由于網絡分析僅能指示微生物潛在的相互作用，同時，生物質炭、植被以及土壤的類型，生物質炭的添加量以及培養時間等因素都可能影響生物質炭與土壤根際土壤細菌-真菌群落相互作用的關系，下一步的研究將考慮上述影響。