施肥和淹水管理對(duì)水稻土氨氧化微生物數(shù)量的影響*

曹彥強(qiáng) 王智慧 莫永亮 王 梅 蔣先軍?

（1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715）（2 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

硝化作用長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是一個(gè)兩步的過程，首先由氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizing bacteria,AOB）和古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）將氨氧化為亞硝酸鹽，再由亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（Nitrite-oxidizing bacteria, NOB）將其氧化為硝酸鹽，從而完成整個(gè)硝化過程。但根據(jù)代謝過程中的動(dòng)力學(xué)理論，由一種微生物來完成氨的兩步氧化過程是可行的［1］。2015年底，科學(xué)家在水生生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了全程氨氧化微生物（Complete ammonia oxidizers，Comammox），能夠直接完成從氨氮到硝氮的氧化，其系統(tǒng)發(fā)育分類地位可歸屬于經(jīng)典的NOB中的硝化螺菌屬（Nitrospira）［2-3］。通過比對(duì)已經(jīng)發(fā)表和尚未發(fā)表的海量宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以及最新的分子生態(tài)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)Comammox廣泛分布于土壤、淡水生態(tài)系統(tǒng)、污水和飲用水處理系統(tǒng)中［2-5］。但是，Comammox如何適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境并與傳統(tǒng)的AOA和AOB相互競(jìng)爭(zhēng)共存，目前仍不清楚，是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

氨氧化過程是在O2存在的條件下，微生物將NH3氧化為亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程。因此，環(huán)境中NH3和O2濃度的變化極有可能是驅(qū)動(dòng)Comammox和AOA及AOB的關(guān)鍵環(huán)境因子。例如，土壤酸堿度是影響氨氧化微生物生態(tài)位分異的重要因素，其主要原因是H+介導(dǎo)的化學(xué)平衡使得酸性土壤中NH3濃度通常在nmol·L-1水平，中性和堿性土壤中在μmol·L-1水平［6］，同時(shí)，AOA對(duì)NH3的親和力遠(yuǎn)高于AOB［7］。因此，AOA通常主導(dǎo)酸性土壤氨氧化［8］，而AOB則在中性和堿性土壤中發(fā)揮作用［9-10］。也有研究發(fā)現(xiàn)，AOA能夠更好地適應(yīng)低O2脅迫，從而在水稻土氨氧化過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。最新的研究則表明，全程氨氧化細(xì)菌Nitrospira inopinata對(duì)底物NH3的親和力遠(yuǎn)高于大多數(shù)可培養(yǎng)的AOA物種，能夠更好地適應(yīng)極低NH3濃度的脅迫環(huán)境［13］。然而，在復(fù)雜土壤環(huán)境中，Comammox對(duì)O2和NH4+-N的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制仍鮮有報(bào)道。

稻田淹水導(dǎo)致其O2濃度遠(yuǎn)低于旱地土壤，而施肥則可能提升NH3濃度刺激氨氧化微生物的生長(zhǎng)。據(jù)此，本研究依托西南大學(xué)1989年設(shè)置的中性紫色水稻土長(zhǎng)期定位試驗(yàn)站，針對(duì)植稻淹水（夏季植稻施肥、全年淹水）和休耕冬干（不植稻、不施肥，僅在夏季植稻期間淹水，冬季排水落干）兩種不同處理下的水稻土，研究施肥和水分管理對(duì)水稻土硝化潛勢(shì)及氨氧化微生物豐度的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于國(guó)家紫色土長(zhǎng)期定位試驗(yàn)基地（106°26′E，30°26′N），地處重慶市北碚區(qū)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫18.30 ℃，年均降雨量1 105 mm，年均日照時(shí)數(shù)1 277 h，年均無霜期334 d。土壤類型為中性紫色水稻土。

1.2 研究方法

長(zhǎng)期定位試驗(yàn)始于1 9 8 9 年，設(shè)植稻淹水（PF）和休耕冬干（FD）兩種種植模式。植稻淹水處理夏季植稻、全年淹水。夏季按照傳統(tǒng)方法翻耕田地后種植水稻，施肥量為尿素273.1 kg·hm-2；過磷酸鈣500.3 kg·hm-2；氯化鉀150.1 kg·hm-2；過磷酸鈣作為底肥一次施用， 尿素2/3做底肥，1/3做追肥，氯化鉀底肥和追肥各1/2。休耕冬干處理全年不種植任何作物，夏季的水分管理與種植水稻相同，4月灌水，8月排水，但不施肥、不耕作、不種植，后期做進(jìn)一步排水處理，全年約7個(gè)月處于落干狀態(tài)。

于2017年11月4日在兩種種植模式地塊分別采集表層(0～5 cm)土壤。采集后立即進(jìn)行氨氧化微生物豐度的測(cè)定，部分土樣風(fēng)干后測(cè)定其基本理化性質(zhì)。

1.3 硝化潛勢(shì)的測(cè)定

硝化潛勢(shì)的測(cè)定采用好氣培養(yǎng)法［14］，稍作修改：稱取 15 g 鮮土置于三角瓶中，加入(NH4)2SO4調(diào)節(jié)-N濃度至0.4 g·kg-1（干土質(zhì)量計(jì)）。將三角瓶置于搖床，室溫25 ℃振蕩24 h。在第2、4、22、24小時(shí)分別取10 mL的振蕩懸濁液，以2液 m中ol·L-1KC的l含溶量液。浸以提培過養(yǎng)濾時(shí)間流動(dòng)為分橫析坐儀標(biāo)測(cè)，定懸濁含量為縱坐標(biāo)，求出斜率，即土壤硝化潛勢(shì)。

1.4 DNA的提取

采用 F a s t D N A? S P I N K i t f o r S o i l(M P Biomedicals)試劑盒提取土壤基因組總DNA，稱取0.5 g土壤樣品，按試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行，將提取的 DNA 保存于-20 ℃用于后續(xù)分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在QuantStudioTM6 Flex定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific，Singapore)上測(cè)定AOA、AOB及Comammox分支A（Clade A）和分支B（Clade B）amoA基因的拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所用的擴(kuò)增引物如表1所示。AOA、AOB、Comammox Clade A、Comammox Clade B的amoA基因定量PCR所用反應(yīng)體系均為20 μL，主要包含：待擴(kuò)增的模板DNA1 μL、上下引物及ROX染料各0.4 μL，Taq DNA 聚合酶10 μL、滅菌水7.8 μL。通過液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)含有目的基因的克隆子，按試劑盒(MiniBEST Plasmid Purification Kit)說明書方法提取、純化質(zhì)粒后，在NanoDrop?ND-1000 UV-Vis分光光度計(jì)上測(cè)定質(zhì)粒的濃度，并計(jì)算出目的基因的拷貝數(shù)。最后用TE緩沖溶液將質(zhì)粒連續(xù)稀釋6～8個(gè)梯度以制作定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。AOA、AOB的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增程序皆為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)。Comammox Clade A、Clade B的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序皆為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，45個(gè)循環(huán)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物Table 1 Real-time PCR Primers used in the study

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 13等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。利用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 長(zhǎng)期不同施肥和淹水管理對(duì)水稻土理化性質(zhì)及硝化潛勢(shì)的影響

植稻淹水及休耕冬干兩種不同模式下水稻土的基本性質(zhì)如表2所示。長(zhǎng)期植稻淹水管理下水稻土的含水量為102.59%，遠(yuǎn)高于對(duì)照處理的34.07%（休耕冬干）。植稻淹水和休耕冬干水稻土中銨態(tài)氮含量分別為17.77、4.09 mg·kg-1；硝態(tài)氮的含量分別為13.86、4.71 mg·kg-1；全氮含量分別為1.76、0.92 g·kg-1。休耕冬干水稻土有機(jī)質(zhì)含量顯著高于植稻淹水處理，分別為20.51、17.55 g·kg-1。長(zhǎng)期施肥顯著刺激了水稻土的硝化潛勢(shì)，植稻淹水和休耕冬干水稻土分別為25.0、2.11 mg·kg-1·d-1，兩者相差高達(dá)12倍。

表2 不同管理模式下水稻土的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physico-chemical properties of the paddy soils relative to treatment

2.2 長(zhǎng)期不同施肥和淹水管理對(duì)水稻土氨氧化微

生物豐度的影響

植稻淹水及休耕冬干這兩種水稻土中氨氧化微生物的豐度如圖1所示。長(zhǎng)期施肥和淹水管理顯著影響了氨氧化微生物類群的豐度。相比于休耕冬干管理，植稻淹水刺激了Comammox Clade A、AOA和AOB的生長(zhǎng)，三者增長(zhǎng)倍數(shù)分別為9倍、3倍、42倍。兩種水稻土中，Comammox的豐度均高于AOA和AOB。植稻淹水中Comammox豐度分別是AOA的8.5倍、AOB的77.3倍，而休耕冬干中Comammox豐度分別是AOA的4.1倍、AOB的490.3倍。

如圖1所示，植稻淹水中Comammox Clade A的豐度高于休耕冬干水稻土，而Clade B的豐度卻低于休耕冬干，但兩種水稻土中，Comammox Clade A 的豐度均要高于Clade B。植稻淹水中Comammox Clade A和Clade B的amoA基因的拷貝數(shù)（以干土計(jì)，下同）分別為1.3 0×1 08copies·g-1、2.39×106copies·g-1；而休耕冬干中Comammox Clade A和Clade B的amoA基因的拷貝數(shù)分別為1.50×107copies·g-1、6.71×106copies·g-1（圖1a，圖1b）。

由圖1c、圖1d可知，植稻淹水中AOA的amoA基因拷貝數(shù)為1.57×107copies·g-1，遠(yuǎn)高于休耕冬干水稻土的5.28×106copies·g-1。AOB的amoA基因拷貝數(shù)為 1.88×106copies·g-1，也高于休耕冬干。這兩種水稻土中AOA的豐度均高于AOB。

圖1 不同管理模式下水稻土中氨氧化微生物的豐度Fig.1 Abundance of the ammonia-oxidizing microorganisms in paddy soils relative to treatment

3 討 論

水稻土是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)土地資源，約占全國(guó)耕地面積的1/5。本研究中，與休耕冬干相比，2 8 年長(zhǎng)期植稻淹水管理極可能導(dǎo)致水稻土生態(tài)位發(fā)生顯著變化，進(jìn)而影響氨氧微生物的生理生態(tài)功能。長(zhǎng)期的施肥和植稻管理，顯著促進(jìn)了水稻土的硝化潛勢(shì)，使其增幅高達(dá)12倍之多。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，兩種水稻土均能檢測(cè)到Comammox、AOA和AOB，并且其數(shù)量均為Comammox＞AOA＞AOB。盡管Comammox豐度高并不意味著其在水稻土硝化過程中發(fā)揮重要作用，但其功能意義卻將是未來研究的重點(diǎn)。例如，植稻淹水條件下，大量施肥導(dǎo)致銨態(tài)氮濃度顯著高于休耕冬干，極高的水分含量也可能導(dǎo)致氧氣濃度顯著低于后者。植稻淹水土壤中，高氨低氧則可能刺激了Comammox Clade A的生長(zhǎng)，而非Clade B，導(dǎo)致兩者的比值高達(dá)54.1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于休耕冬干水稻土中的比值2.2（表3）。事實(shí)上，已有研究針對(duì)旱地土壤僅檢測(cè)到Comammox Clade B，而未發(fā)現(xiàn)Clade A［18］。這些結(jié)果也許暗示著Comammox Clade A更適應(yīng)低氧的淹水環(huán)境，而Clade B可能在高氧的旱地土壤中具有生理活性。

表3 不同管理模式下水稻土中氨氧化微生物的數(shù)量比Table 3 Ratio of ammonia-oxidizing microorganisms in paddy soils relative to treatment

施肥通常能夠增加土壤銨態(tài)氮濃度并刺激土壤硝化活性。植稻淹水中銨態(tài)氮的濃度達(dá)到了17.77 mg·kg-1，是休耕冬干水稻土的4倍多。底物濃度對(duì)氨氧化微生物的相對(duì)豐度和分布起著重要的作用，新發(fā)現(xiàn)的Comammox被證實(shí)能夠更好地適應(yīng)于極低氨濃度的環(huán)境。本研究在休耕冬干水稻土中檢測(cè)到的Comammox Clade B的amoA基因的拷貝數(shù)也確實(shí)要高于底物濃度較高的植稻淹水水稻土。相比于植稻淹水，休耕冬干水稻土每年4—8月淹水，隨后處于落干狀態(tài)。土壤水分也是影響硝化微生物活性的重要因素，通過控制空氣中O2的擴(kuò)散而間接影響好氧微生物的活性。目前已知的所有氨氧化微生物皆為好氧生長(zhǎng)類型，也有研究指出AOA和AOB對(duì)水分條件和氧氣的要求不同［19-20］，但Comammox對(duì)氧氣脅迫的適應(yīng)機(jī)制尚不清楚。盡管無法區(qū)分施肥和淹水管理對(duì)氨氧化微生物功能的相對(duì)影響，但全年淹水的植稻水稻土中Comammox Clade A更高，表明其能更好適應(yīng)氧氣脅迫，并可能具有更為廣泛的底物適應(yīng)范圍。

盡管植稻淹水和休耕冬干水稻土中A O A 和AOB數(shù)量均顯著低于Comammox，但數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)并不一定具有功能意義，目前的研究并不能排除AOA和AOB在硝化過程中發(fā)揮了重要作用。事實(shí)上已有的研究表明不同母質(zhì)水稻土中，AOA和AOB對(duì)硝化作用的相對(duì)貢獻(xiàn)明顯不同［12］。此外，本研究表明與AOB相比，AOA適應(yīng)低氨脅迫的能力更強(qiáng)。例如，盡管植稻淹水中AOA和AOB的豐度均要高于休耕冬干水稻土，但在休耕冬干水稻土中，兩者豐度的比值卻高達(dá)118.3，遠(yuǎn)高于植稻淹水中的9.2，說明在銨態(tài)氮濃度較低的休耕冬干水稻土中，AOA較之AOB具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)（表3）。這些結(jié)果與已有的報(bào)道一致，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中較低的銨態(tài)氮濃度下能夠觀察到更高的AOA∶AOB的比值［21］。

農(nóng)業(yè)種植模式、化肥施用、灌溉管理以及土壤類型等均會(huì)對(duì)微生物數(shù)量、活性與種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響［22-25］。而硝化作用是農(nóng)田氮循環(huán)的關(guān)鍵過程，其發(fā)生與速率主要受氨氧化微生物的豐度和活性制約。Comammox的發(fā)現(xiàn)表明在農(nóng)田土壤硝化過程仍有大量亟待解決的科學(xué)問題。首先，由于氨被完全氧化成硝酸鹽可以釋放出更高的能量，那么在什么情況下Comammox對(duì)硝化作用的貢獻(xiàn)會(huì)超過別的硝化微生物？以往對(duì)Comammox的忽視是否導(dǎo)致過高估計(jì)了傳統(tǒng)硝化微生物的功能？此外，尤為重要的是要了解Comammox與傳統(tǒng)氨氧化微生物（AOA和AOB）的生態(tài)位劃分及其功能意義。例如，以往穩(wěn)定性同位素示蹤氨氧化微生物DNA試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Nitrospira中類群在13C-DNA中的豐度遠(yuǎn)高于AOA和AOB［12］，但這些微生物是否為Comammox并在土壤氨氧化過程中發(fā)揮了重要作用，仍待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

在植稻淹水和休耕冬干水稻土中都檢測(cè)到了較高豐度的Comammox，表明Comammox廣泛分布于水稻土壤中，并有可能在水稻土的硝化過程中發(fā)揮重要作用。此外，水稻土中Comammox Clade A的豐度要高于Clade B，長(zhǎng)期的施肥和淹水管理會(huì)對(duì)水稻土中Comammox的兩個(gè)分支的豐度產(chǎn)生一定影響。施肥種植可能刺激了Comammox Clade A、AOA和AOB的生長(zhǎng)。