基于納米抗體CDR3區(qū)抗原表位展示的β-HCG抗體制備及鑒定

王蕾，霍景瑞，張國安，賈力，田毅，楊曉暉，張晶晶，劉穎，吳楠，劉英富，3△

重鏈抗體是一種存在于駱駝體內(nèi)的只有兩條重鏈組成的抗體結(jié)構(gòu)，其重鏈的可變區(qū)是抗原結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)，在單獨(dú)存在的情況下，同樣具有抗原結(jié)合的能力，由于重鏈抗體的可變區(qū)分子直徑小于100nm，并具備抗原結(jié)合能力，因此該結(jié)構(gòu)又被稱為納米抗體［1］。抗體能夠與抗原結(jié)合，發(fā)揮檢測和拮抗抗原的功能，抗獨(dú)特型抗體研究發(fā)現(xiàn)，抗體同樣可以作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生針對抗體的抗體［2-3］，抗體用作抗原進(jìn)行免疫產(chǎn)生抗體反應(yīng)，與抗體的可變區(qū)關(guān)系密切，納米抗體作為小分子抗體，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、親和力高、可溶性好等優(yōu)勢［4-5］，在疾病的診斷、檢測等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［6-9］，而納米抗體作為抗原表位展示載體少有報(bào)道，本研究以β-人絨毛膜促性腺激素（β human chorionic gonadotropin，β-HCG）為研究靶蛋白，將β-HCG的C端短序列構(gòu)建到納米抗體可變區(qū)的CDR3 區(qū)，評估納米抗體進(jìn)行表位展示的方法在抗體制備中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌BL21（DE3）、PET24a 表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存，引物、展示β-HCG C 端表位（氨基序列151～165）的納米抗體基因（Nb-HCGβe）由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成；內(nèi)切酶、膠回收試劑盒、DNA 連接酶、DL2000、蛋白Marker、大鼠抗兔二抗均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、Nb-HCGβe 偶聯(lián)凝膠介質(zhì)購自天津泰克迪恩生物科技有限公司；α-HCG、β 促黃體生成素（β Luteinizing hormone，β-LH）蛋白購自北京景達(dá)生物科技有限公司，β-HCG 由本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化。新西蘭大耳白兔購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004；免疫佐劑購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 β-HCG 表位選擇與Nb-HCGβe 基因合成 納米抗體為前期實(shí)驗(yàn)室采集羊駝外周血分離淋巴細(xì)胞，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增并測序得到的多個(gè)納米抗體序列中，隨機(jī)抽取其中一個(gè)納米抗體作為表位展示載體。選擇β-HCG C 末端（氨基序列151～165）15 個(gè)氨基酸長度，通過基因合成的方式，插入到納米抗體CDR3 區(qū)，合成含β-HCG C 端表位的納米抗體（Nb-HCGβe）基因，合成的基因含EcoRⅠ、XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。

1.2.2 Nb-HCGβe 載體構(gòu)建、表達(dá)、純化 將合成的Nb-HCGβe 基因、原核表達(dá)載體pET24a 分別用內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別膠回收，連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21（DE3）宿主菌，挑單克隆菌液PCR 鑒定，將鑒定陽性的宿主菌進(jìn)一步測序鑒定。測序正確的樣品，37 ℃搖菌培養(yǎng)，OD600達(dá)到0.8時(shí)，加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，誘導(dǎo)結(jié)束后，冰浴超聲破碎大腸桿菌（超聲條件：功率400 W，工作5 s，間隔5 s，時(shí)長3 min），超聲后樣品12 000 r/min 離心10 min，分別收集上清、沉淀，SDS-PAGE電泳觀察超聲后上清、沉淀蛋白表達(dá)情況，根據(jù)表達(dá)結(jié)果，大量制備Nb-HCGβe，His 標(biāo)簽金屬螯合親合層析填料進(jìn)行純化。

1.2.3 Nb-HCGβe 免疫及血清效價(jià)檢測 月齡3 個(gè)月，體質(zhì)量1.5 kg 的大耳白兔2 只，飼養(yǎng)1 周開始免疫，Nb-HCGβe 抗原600 μg/只，初次免疫，弗氏完全佐劑蛋白乳化，皮下多點(diǎn)注射，初次免疫之后第14、21、28、35天采用弗氏不完全佐劑蛋白乳化，腹腔注射免疫，最后1 次免疫結(jié)束1 周后，取血檢測效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1∶100 000以上，視為免疫成功。

1.2.4 Nb-HCGβe 多抗純化及效價(jià)檢測 采集免疫成功的兔外周血，離心收集上清并與結(jié)合緩沖液1∶1 混合，0.45 μm濾器過濾，上樣過Nb-HCGβe 偶聯(lián)介質(zhì)，結(jié)合緩沖液沖洗柱至檢測器基線，0.1 mol/L Glycine-HCl（pH=2.7）洗脫液洗脫，洗脫樣品用1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH=9.0）快速中和。純化的抗體SDS-PAGE 蛋白電泳，檢測抗體的純化效果，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法進(jìn)一步檢測純化抗體的效價(jià)，以未免疫的兔多抗作為對照。

1.2.5 Nb-HCGβe 多抗Western blot 特異性檢測 檢測樣品含Nb-HCGβe、β-HCG、A549細(xì)胞裂解液、α-HCG、β-LH、不含HCG 表位的納米抗體做對照（Nb-C），SDS-PAGE 蛋白電泳，電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，Nb-HCGβe偶聯(lián)介質(zhì)純化的抗體作為一抗（1∶10 000稀釋），4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3 次，二抗（1∶10 000 稀釋）37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入發(fā)光液檢測，未免疫血清為對照。

2 結(jié)果

2.1 Nb-HCGβe 載體構(gòu)建及鑒定 通過基因合成的方式，將β-HCG C 端序列插入到納米抗體的CDR3區(qū)，合成的Nb-HCGβe雙酶切后，連接pET24a原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化BL21（DE3）宿主菌，挑取4 個(gè)生長菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示：4個(gè)菌落中1 個(gè)未見條帶，3 個(gè)出現(xiàn)陽性條帶，與預(yù)測大小一致（396 bp），見圖1。3個(gè)陽性克隆中，隨機(jī)挑取1個(gè)送檢測序，測序結(jié)果正確。

圖1 Nb-HCGβe 菌液PCR鑒定

2.2 Nb-HCGβe 表達(dá)、純化 Nb-HCGβe 經(jīng)原核表達(dá)和IPTG 誘導(dǎo)后，SDS-PAGE 蛋白電泳結(jié)果顯示，Nb-HCGβe轉(zhuǎn)化BL21（DE3）誘導(dǎo)后，在15 ku位置有目的條帶表達(dá)，經(jīng)超聲破碎處理，表達(dá)的蛋白主要存在超聲沉淀中，以包涵體的形式存在，見圖2A。經(jīng)包涵體洗滌，將8 mol/L 尿素裂解的蛋白進(jìn)行His 標(biāo)簽純化，經(jīng)低濃度（5、10、20 mmol/L）咪唑去除雜蛋白，高濃度（100 mmol/L）咪唑洗脫獲得目的蛋白純度大于98%，見圖2B。

2.3 Nb-HCGβe血清效價(jià)檢測 純化的Nb-HCGβe經(jīng)復(fù)性處理后，免疫新西蘭大耳白兔，免疫5 次后，第6 周耳緣靜脈采集外周血，采用間接ELISA 法進(jìn)行效價(jià)檢測，2 只免疫后的兔血清效價(jià)均可達(dá)到1∶512 000，見圖3。

Fig.2 Expression and purification of Nb-HCGβe圖2 Nb-HCGβe的表達(dá)、純化

Fig.3 Titer detection of Nb-HCGβe immune serum圖3 Nb-HCGβe 免疫血清效價(jià)檢測

2.4 Nb-HCGβe 免疫血清純化及檢測 免疫后的兔血清，抗原偶聯(lián)介質(zhì)純化，得到抗Nb-HCGβe多抗（pAn-Nb-HCGβe），SDS-PAGE 電泳檢測抗體純化效果，能明顯觀察到重鏈、輕鏈兩條帶，見圖4A，純化后的抗體倍比稀釋，抗體濃度約為0.02 mg/L 時(shí)，仍能夠檢測到陽性反應(yīng)，見圖4B。

2.5 Nb-HCGβe 多抗Western blot 鑒定 Western blot結(jié)果顯示，pAn-Nb-HCGβe能夠特異性結(jié)合Nb-HCGβe、β-HCG、A549 細(xì)胞裂解液中的β-HCG，與α-HCG、β-LH 未發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，見圖5A，Nb-HCGβe 免疫血清可以檢測到與Nb-C、Nb-HCGβe、β-HCG、A549 細(xì)胞裂解液4 個(gè)樣品的陽性反應(yīng)，同樣未檢測出α-HCG、β-LH，見圖5B，對照血清與上述樣品均未反應(yīng)。

Fig.4 Purification and detection of antibody Nb-HCGβe圖4 Nb-HCGβe抗體純化及測定

Fig.5 Western blot specific detection of Nb-HCGβe antibody圖5 Nb-HCGβe抗體免疫印跡特異性檢測

3 討論

抗體在疾病的診斷、治療及基礎(chǔ)研究方面發(fā)揮著日益重要的作用，抗體的制備研究對推動(dòng)生命科學(xué)發(fā)展具有重要意義。在抗體制備過程中，抗原是抗體制備的基礎(chǔ)，天然蛋白是抗體制備的理想抗原，然而由于天然蛋白往往存在著提取、表達(dá)、復(fù)性困難等各種各樣的問題，以載體蛋白表位展示、噬菌體表位展示為代表的多種展示技術(shù)在抗原替代研究中得到廣泛應(yīng)用［10-11］。

匙孔血藍(lán)蛋白（KLH）、雞卵白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）是常用的展示載體［12-14］，但這些載體在表位展示時(shí)需要較復(fù)雜的表位偶聯(lián)過程，為抗原的表位展示帶來了不便。抗體作為抗原表位展示工具，在眾多表位展示載體中具有較大優(yōu)勢，如抗體可變區(qū)本身就是多變的結(jié)構(gòu)序列，其序列的變化不影響抗體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，具有較好的表位展示功能。抗體種類多樣，包含傳統(tǒng)重鏈、輕鏈組成的四鏈抗體、單鏈抗體、納米抗體等類型，傳統(tǒng)抗體、單鏈抗體都有相關(guān)抗原表位展示的研究報(bào)道［2-3］。而納米抗體用來展示抗原表位少有報(bào)道，納米抗體CDR3 區(qū)結(jié)構(gòu)比傳統(tǒng)抗體的相應(yīng)區(qū)域要較長，彌補(bǔ)了輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降，同時(shí)較長的CDR3 區(qū)對抗體的免疫原性具有重要的貢獻(xiàn)作用［4］，更加適合用于抗原表位的展示，同時(shí)納米抗體分子質(zhì)量小，產(chǎn)生的無關(guān)抗體相對較少，易于單克隆抗體的篩選，是較為理想的表位展示載體。

為驗(yàn)證納米抗體CDR3 區(qū)表位的展示功能，本研究以β-HCG 為研究對象，進(jìn)行其抗體的制備研究。HCG 分為a、β 兩個(gè)亞單位，α 亞基與垂體分泌的β-LH、卵泡刺激素（FSH）、促甲狀腺激素（TSH）結(jié)構(gòu)基本相似，β-HCG與β-LH結(jié)構(gòu)相近，其中游離β-HCG 的升高與乳腺癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［15-17］，是多種腫瘤的標(biāo)志物，通過檢測血液β-HCG的變化，可提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性。

β-HCG與β-LH結(jié)構(gòu)相近，但β-HCG羧基端最后24 個(gè)氨基酸延長部分在β-LH 中不存在，為提高檢測的特異性，本研究選擇β-HCG羧基端特異性結(jié)構(gòu)序列，通過基因合成的方式，將β-HCG 羧基端序列插入到納米抗體的CDR3 區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，雖然納米抗體具有較好的可溶性［18］，而本研究在進(jìn)行表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的含β-HCG表位的納米抗體在表達(dá)時(shí)主要是包涵體的形式，可能與表達(dá)載體有很大的關(guān)系。本研究選擇的PET24a 表達(dá)系統(tǒng)有較強(qiáng)的原核表達(dá)能力，載體表達(dá)量大、表達(dá)速度快，可能是影響其可溶性的主要原因。雖然表達(dá)的Nb-HCGβe為包涵體，為了使β-HCG抗原表位能夠以空間結(jié)構(gòu)的形式存在，本研究對包涵體做了復(fù)性處理，由于納米抗體具有較高的水溶性，易于復(fù)性，將復(fù)性的蛋白免疫動(dòng)物，獲得了針對Nb-HCGβe的多抗。

在對多抗的檢測中，本研究選擇了Nb-C、Nb-HCGβe、β-HCG、A549 細(xì)胞裂解液、α-HCG、β-LH進(jìn)行了特異性檢測。而在檢測過程中需要注意，β-HCG 由165 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量理論預(yù)測值為18.1 ku，而由于其高度的糖基化，其實(shí)際分子質(zhì)量約為22.2 ku。Western blot 檢測結(jié)果顯示，Nb-HCGβe偶聯(lián)介質(zhì)純化獲得的多抗僅能夠檢測到Nb-HCGβe、β-HCG、A549細(xì)胞裂解液陽性反應(yīng)，而未純化的免疫血清不但能夠檢測上述3 種樣品，還可以檢測不含β-HCG 表位的Nb-C 對照納米抗體，提示納米抗體作為展示載體展示時(shí)，不但產(chǎn)生了針對CDR3區(qū)表位的抗體，同樣產(chǎn)生了針對納米抗體其他部位的抗體。

綜上所述，本研究采用納米抗體展示β-HCG抗原表位的方法，能夠制備針對完整β-HCG 的抗體，在此基礎(chǔ)上，今后將圍繞單克隆抗體篩選及抗體標(biāo)記技術(shù)，開展相關(guān)的研究，同時(shí)，由于自然界抗原種類多種多樣、蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，該方法能否適用其他蛋白，仍需要更多的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。