microRNA-125b在膿毒癥急性肺損傷中的表達及其與炎癥因子水平相關性

吳松林，田小利，徐陶，雷賢英，伍長學，甘辭海

膿毒癥是指因感染引起宿主反應失調而導致危及生命的器官功能障礙［1］。當前臨床普遍認為，膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應綜合征［2］；感染可能引起免疫抑制及機體過度炎癥反應，從而導致膿毒癥發生［3-4］。急性肺損傷是一種以彌漫性肺實質損傷為基礎，肺水腫和肺不張為病理特征，并迅速影響氣體交換功能的臨床綜合征［5-6］。而急性肺損傷作為機體過度炎癥反應的結果，調控炎癥反應的發生與發展可以防止急性肺損傷的發生［7］，對降低病死率具有重要的臨床意義［8］。因此，急性肺損傷生物學標志物的探索，對膿毒癥早期的診斷、療效判斷以及預后評估都有重要意義［9］。微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一類內源性小分子非編碼RNA，在轉錄后調控基因的表達［10-11］。研究表明，多種miRNAs 在膿毒癥的炎癥反應中起著重要的作用［12-13］，miR-125b 已被發現在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、胰腺癌、子宮內膜癌等癌癥中表達異常，但是關于miR-125b在膿毒癥誘發的急性肺損傷中的研究尚少見相關報道［14-16］。本研究通過體外構建膿毒癥急性肺損傷大鼠模型，探索miR-125b的表達水平與炎癥因子的相互關系，以及其在急性肺損傷中對炎癥的調控機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養液（NO.C10782730BT，美國Gbico 公司），胎牛血清（NO.10099，美國Gbico 公司），0.25%胰酶（Lot：20170321，美國Invitrogen 公司），CO2細胞培養箱（Heraeus，德國），倒置顯微系統（TH4-200，日本OLYMPUS），TaqMan?RNA Reverse Transcription kit 試劑盒（Lot：20170634，美國ABI 公司），Lipofectamine 3000 Reagent（No.M0124，美國賽默飛生物公司），PCR 儀（iCycler Thermal Cycler，美國BIO-RAD 公司），凝膠圖像分析系統（Biosens SC710，美國BIOTOP 公司），熒光定量PCR 儀（Light Cycler480，美國羅氏生物），低速離心機（TDL5，上海安亭科學儀器廠），脂多糖（LPS，美國Sigma 公司），固型標準普通飼料（北京科澳飼料公司）。

1.2 實驗動物與分組 清潔級SD大鼠100 只，雄性，5周齡，體質量195～230 g，購自上海南方模式動物中心，于我院動物科學研究室進行喂養，4 只/每籠，以固型標準普通飼料飼養于24 ℃室溫，12 h 光照，濕度44%～50%環境下。將100只SD 大鼠隨機均分為5組：對照組注射等量的生理鹽水；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）4 h、8 h、12 h 及24 h 組，腹腔注射10 mg/kg的LPS相應時長后處死大鼠。

1.3 肺組織形態學觀察 各組大鼠處死后取肺組織，10%福爾馬林固定，脫水后石蠟包埋。4 μm組織切片后經蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，光鏡（×100）下觀察肺組織切片病理學變化。

1.4 肺組織miR-125b、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）與白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）檢測 提取肺組織總RNA，逆轉錄后得到cDNA，反應條件：16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min，4 ℃保存。采用TaqMan?Universal PCR Master Mix 進行熒光定量PCR。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，55～60 ℃退火及延伸30 s，共40 個循環。以U6 為miR-125b內參，以β-actin為TNF-α 和IL-6 的內參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物信息見表1。

1.5 NR8383 細胞的培養與分組 （1）細胞培養。大鼠肺泡巨噬細胞NR8383 細胞株由中科院上海細胞庫提供，由液氮罐中迅速取出凍存的細胞，37 ℃水浴解凍并接種，添加DMEM 培養液5 mL，于37 ℃、5%CO2培養箱培養，每2 d換液1 次。貼壁細胞進行傳代前達到80%左右融合度，采用0.25%的胰酶消化后收集細胞懸液；4 ℃3 000 r/min 離心2 min，棄去上清，加入1×PBS重懸細胞1 mL，按1×105/mL密度接種。（2）LPS 誘導NR8383 細胞系。將NR8383 細胞系根據不同的處理方式分為2組，空白對照組不進行LPS刺激，實驗組加入LPS 刺激4 、8 、12、24 h 時收集細胞。（3）細胞轉染。取培養3～5 代細胞，嚴格按照Lipofectamine?3000 Transfection Reagent 說明書進行操作；陰性對照組只轉染空表達質粒；miR-125b mimic 組轉染miR-125b mimic 表達質粒，以提高細胞內源miR-125b 的表達水平；miR-125b inhibitor 組轉染miR-125b inhibitor 表達質粒，以抑制細胞內源miR-125b的表達水平。

Tab.1 Primer sequence information表1 各引物序列信息

1.6 Western blot檢測Notch1蛋白表達 分別取各轉染組等量細胞，經12.5%SDS-PAGE 凝膠電泳（90 V 恒壓）分離，恒流轉移后，3%BSA室溫封閉1 h，按1∶500濃度加入Notch1單克隆抗體（1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜，漂洗辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000 稀釋），室溫孵育30 min 后PBS 緩沖液洗滌，加入ECL 化學發光劑曝光成像。對成像之后的膠片，采用密度掃描儀對各個條帶的吸光度值進行定量，以β-actin作為內參照，使用其灰度值差值來表示Notch1 的相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用2獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素的方差分析，組間多重比較用采用LSD-t檢驗；實驗組相關性分析采用Pearson相關系數。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化 LPS 腹腔注射4 h后對照組肺組織結構清晰可見，肺泡壁完整清晰、間質無滲出、無炎癥細胞浸潤、肺泡腔內無水腫液、出血，見圖1A；LPS 腹腔注射8、12、24 h 后各組大鼠肺泡隔毛細血管及肺微血管擴張充血，雙肺體積增大，明顯肺水腫，肺泡壁破損，肺泡隔及肺泡腔內大量液體及紅細胞滲出，可見炎癥細胞浸潤，偶有透明膜形成，肺泡大小不一，肺泡間隔明顯增厚，見圖1B～E。

2.2 各組肺組織中miR-125b、TNF-α 以及IL-6 的表達水平比較 與對照組比較，LPS 各組TNF-α、IL-6的相對表達量均升高，miR-125b相對表達量均降低（P＜0.05）；與LPS 4 h 組相比，LPS 8 h 組、LPS 12 h 組及LPS 24 h 組TNF-α、IL-6 的相對表達量均降低，miR-125b相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-125b,TNF-α and IL-6 in lung tissues of rats between five groups表2 各組大鼠肺組織中miR-125b、TNF-α以及IL-6 mRNA的表達水平比較（n=20，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-125b,TNF-α and IL-6 in lung tissues of rats between five groups表2 各組大鼠肺組織中miR-125b、TNF-α以及IL-6 mRNA的表達水平比較（n=20，±s）

＊P＜0.05；a 與對照組比較，b 與LPS 4 h 組比較，c 與LPS 8 h 組比較，d與LPS 12 h組比較，P＜0.05

組別對照組LPS 4 h組LPS 8 h組LPS 12 h組LPS 24 h組F TNF-α 0.68±0.31 2.67±0.72a 1.68±0.47ab 1.53±0.31ab 1.59±0.42ab 45.093＊IL-6 0.53±0.22 1.82±0.68a 1.34±0.31ab 1.09±0.32abc 1.31±0.29abd 27.597＊miR-125b 1.48±0.53 0.61±0.12a 0.58±0.10a 0.63±0.15a 0.59±0.11a 45.421＊

2.3 肺組織中miR-125b表達與TNF-α、IL-6 的表達相關性分析 實驗組肺組織中miR-125b與TNF-α、IL-6 呈負相關（r分別為-0.599、-0.580，P＜0.05）。

2.4 NR8383 細胞系中miR-125b、TNF-α 以及IL-6的表達檢測 在LPS誘導的第4、8、12、24 h，實驗組NR8383 細胞系miR-125b表達水平均低于對照組，而TNF-α、IL-6 的表達水平均高于對照組（P＜0.05），見表3。

2.5 Notch1在NR8383細胞系中的表達檢測 與陰性對照組比較，miR-125bmimic組miR-125b相對表達量升高、Notch1 蛋白相對表達量則降低（P＜0.05），miR-125binhibitor組miR-125b相對表達量降低、Notch1 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與miR-125bmimic 組比較，miR-125binhibitor 組miR-125b相對表達量降低、Notch1 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），見表4、圖3。

Tab.3 Comparison of expression levels of miR-125b,TNF-α and IL-6 in NR8383 cells between different time points表3 不同時間點各組NR8383細胞中miR-125b、TNF-α以及IL-6的表達比較（n=20，±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of miR-125b,TNF-α and IL-6 in NR8383 cells between different time points表3 不同時間點各組NR8383細胞中miR-125b、TNF-α以及IL-6的表達比較（n=20，±s）

＊P＜0.05

組別對照組實驗組t miR-125b TNF-αIL-6 4 h 1.39±0.35 0.76±0.13 7.546＊8 h 1.45±0.41 0.71±0.15 7.580＊12 h 1.40±0.32 0.69±0.11 9.384＊24 h 1.38±0.31 0.63±0.13 9.978＊4 h 0.61±0.18 2.16±0.58 11.414＊8 h 0.65±0.17 2.01±0.43 13.154＊12 h 0.67±0.19 1.93±0.36 13.843＊24 h 0.60±0.14 1.90±0.32 16.645＊4 h 0.47±0.09 1.91±0.54 19.373＊8 h 0.51±0.10 1.80±0.43 13.678＊12 h 0.49±0.11 1.69±0.41 12.642＊24 h 0.48±0.10 1.67±0.38 13.544＊

Tab.4 Comparison of expression levels of miR-125b and Notch1 between three groups of cells表4 各組細胞中miR-125b與Notch1的表達比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of expression levels of miR-125b and Notch1 between three groups of cells表4 各組細胞中miR-125b與Notch1的表達比較（n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與陰性對照組比較，b與miR-125b mimic組比較，P＜0.05

組別陰性對照組miR-125b mimic組miR-125b inhibitor組F miR-125b相對表達量1.42±0.23 2.14±0.56a 0.76±0.12ab 22.514＊Notch1相對表達量1.12±0.18 0.43±0.07a 1.83±0.42ab 41.286＊

Fig.3 Western blot analysis of Notch1 protein expression in three groups of cells圖3 Western blot檢測各組細胞中Notch1蛋白表達

3 討論

感染與創傷是急性肺損傷發病的最常見原因，可直接或間接引起不同程度的肺損傷［17］。促炎反應被啟動的同時，抗炎反應也被啟動，兩者之間的平衡與傾斜決定著整個炎癥過程的歸宿，因此如何控制急性肺損傷過程中免疫炎癥反應，對于急性肺損傷的治療至關重要［18］。

miRNAs作為一種新的基因表達調節物，它與目的mRNA結合后，可抑制目的mRNA翻譯或降解，參與多種生物過程的信號通路調控［19］。孟建斌等［20］研究發現，膿毒癥引發急性肺損傷患者外周血中miR-146a 的表達顯著升高。Shi 等［21］研究發現，小鼠肺組織在進行LPS 刺激后，有46 種miRNAs 的表達明顯上調，多種炎癥相關因子表達下調，表明miRNAs參與肺部的急性炎癥反應。miR-125b主要參與細胞的增殖分化、凋亡等生理過程，在腫瘤的形成與發展過程中發揮重要功能［22］。Priyanka 等［23］研究發現，miR-125b通過靶向調控Line28A，參與造血干細胞和神經干細胞中的分化過程。Hu 等［24］發現miR-125b能抑制巨噬細胞內源干擾素調節因子的表達，從而參與機體的免疫炎癥反應；但是關于miR-125b在膿毒癥急性肺損傷中的研究鮮有報道。

本研究通過建立膿毒癥急性肺損傷大鼠模型發現，相比于對照組大鼠，miR-125b的相對表達水平在LPS腹腔注射的第4、8、12、24 h后均明顯降低，提示miR-125b在急性肺損傷大鼠肺組織中的表達顯著降低；而TNF-α 與IL-6 的表達則顯著升高；實驗組miR-125b的表達水平與TNF-α、IL-6表達水平呈顯著負相關，表明隨著miR-125b表達的降低，細胞內源TNF-α 與IL-6 的表達顯著升高。在巨噬細胞NR8383細胞株中加入LPS誘導后的不同時間段，細胞內源miR-125b的表達水平較對照組均下調，TNF-α、IL-6的表達水平上升；這與Hu等［24］研究相似，提示膿毒血癥導致的急性肺損傷中，miR-125b低表達可上調炎癥相關調節因子，參與肺部炎癥反應。細胞轉染實驗顯示，降低NR8383細胞內源miR-125b的表達時，Notch1 表達水平升高，而當提高NR8383 細胞內源miR-125b的表達時，細胞內源Notch1蛋白表達水平下降，表明miR-125b可能通過靶向調控Notch1蛋白的表達，抑制TNF-α與IL-6的表達。

綜上所述，在膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織中，miR-125b的表達水平顯著降低，而相關炎癥因子，如TNF-α與IL-6的表達則顯著升高，提示三者均參與了體內的炎癥反應；在膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織中，miR-125b可能通過調控細胞內源靶基因Notch1 蛋白的表達，從而抑制TNF-α 與IL-6 的表達，負向調控機體的免疫炎癥反應，有利于抑制膿毒癥急性肺損傷的進一步發生，這為臨床治療膿毒癥急性肺損傷提供了一定的實驗依據。

Fig.1 HE staining results of lung tissues in five groups of rats（×400）圖1 各組大鼠模型肺組織HE染色結果（×400）