五味子乙素對缺血誘導人牙髓細胞的影響及作用機制研究

布 斐 苗玉珠

（陽谷縣人民醫院口腔科，山東 聊城 252300）

五味子乙素（schisandrin B，Sch B）是從中藥五味子中提取得到的天然化合物之一，其具有抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡的作用[1-3]。可以增加細胞內抗氧化劑的含量，增強各種抗氧化酶的活性，同時可以增強線粒體的功能和結構的完整性，對細胞損傷均有一定的保護作用[4-8]。但是五味子乙素對人牙髓細胞的影響及作用機制尚無定論。本研究通過LPS對體外培養的牙髓細胞增殖、堿性磷酸酶活性以及FAK、ERK、Akt表達的影響，旨在通過FAK/ERK/Akt信號通路探討脂多糖（LPS）對缺血誘導人牙髓細胞的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料。試劑：牙髓細胞是選取25歲以下因正畸原因拔出無病變牙的患者的牙髓組織；五味子乙素（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號W-001-500）；MTT、鼠抗人波形蛋白、鼠抗人角蛋白抗體一抗、二抗均購自美國Signal公司；逆轉錄試劑盒購自TransGen公司；RTPCR試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，其他試劑均為化學分析純。

1.2 牙髓細胞的培養與鑒定：收集25歲以下因正畸原因拔出無病變牙的患者的牙髓組織，無菌條件下將其剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，置于含有15%FBS H-DMEM培養液的培養瓶中，在條件為37 ℃、含有5% CO2的培養箱中培養，用倒置顯微鏡觀察牙髓細胞的形態及生長情況；細胞生長融合至80%～90%的時候，采用0.25%的胰蛋白酶消化并傳代。選取第3～5代牙髓細胞進行化學染色鑒定

1.3 實驗分組：選取生長狀態良好的第3～5代牙髓細胞，以5×104個/mL的密度將其接種于帶有細胞蓋玻片的48孔板中，在條件為37 ℃、含有5%CO2的培養箱中培養3～5 d，每孔體積為500 μL。待細胞貼壁后將其分為6組，藥物組分別加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的五味子乙素，空白對照組不添加任何誘導劑。

1.4 檢測指標

1.4.1 MTT法檢測各組細胞增殖率：采用MTT法檢測五味子乙素對牙髓細胞增殖率的影響。選取生長狀態良好的第3～5代牙髓細胞，以5×104個/mL的密度將其接種于帶有細胞蓋玻片的48孔板中，在條件為37 ℃、含有5% CO2的培養箱中培養3～5 d，每孔體積為500 μL，藥物組的五味子乙素的濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L，同時以等體積H-DMEM培養液的培養液作為空白對照組，各組重復3孔。收集五味子乙素處理48 h后的各組細胞，更換無血清培養基培養12 h，使細胞周期同步化。離心收集細胞，沿壁管緩緩加入預冷的70%的乙醇，固定過夜。加入少量PBS洗滌，1000 r/min離心5 min，去乙醇液，洗2遍，再加入0.5 mL的PBS重懸細胞，加入PI和RNasea至終濃度為50 μg/mL，室溫避光孵育30 min，區分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞、壞死細胞，采用流式細胞儀分析細胞凋亡的情況，得到4個象限組成的細胞直方圖，一式3份。

1.4.2 RT-PCR檢測牙髓細胞中ALP、DSPP、HtrA1、TGF-β1mRNA的表達量：選取生長狀態良好的第3～5代牙髓細胞，以5×104個/mL的密度將其接種于帶有細胞蓋玻片的48孔板中，在條件為37 ℃、含有5%CO2的培養箱中培養3～5 d，每孔體積為500 μL，加入含有15%FBS H-DMEM培養液的培養瓶中培養24 h，藥物組的五味子乙素的濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L，同時以等體積H-DMEM培養液的培養液作為空白對照組，各組重復3孔。提取細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，將cDNA置于-20 ℃中備用。反應條件如下：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃反應60 s，共進行40個循環，72 ℃延伸5 min，4 ℃反應5 min，每組進行3次獨立測定，圖像分析儀掃描凝膠密度，分析得到mRNA的相對含量。

1.4.3 Western blot檢測牙髓細胞中FAK、ERK、AKT的表達：采用western blot（WB）檢測不同濃度五味子乙素對牙髓細胞中FAK、ERK、AKT的表達的影響。

1.5 統計學分析：應用SPSS19.0軟件對數據進行分析，結果用s）表示，使用單因素方差分析或t檢驗對不同分組數據進行比較，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 牙髓細胞形態觀察及鑒定：細胞培養5 d后可以發現原代細胞從牙髓組織周圍爬出，細胞生長狀態良好，呈現長梭形漩渦狀排列，進行傳代后的細胞狀態比較穩定。化學染色鑒定結果發現，傳代后的細胞波形蛋白染色結果顯示陽性，角蛋白染色結果顯示陰性，結果說明此細胞來源于中胚層，具有牙髓細胞的生物學特性。

2.2 五味子乙素對細胞增殖率的影響：結果顯示，不同濃度的五味子乙素分別處理牙髓細胞24、48、72 h后，各藥物組細胞增殖率均高于無藥物組（P<0.01），牙髓細胞的增殖率隨著五味子乙素濃度的增加以及藥物作用時間的延長呈現逐漸增強的趨勢，且與藥物濃度和時間呈現一定的依賴性。見表1。

表1 五味子乙素對細胞增殖率的影響

表1 五味子乙素對細胞增殖率的影響

注：與無藥物組相比，**P<0.01

處理時間 24 h(%) 48 h(%) 72 h(%)0 μmol/L 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00 0.625 μmol/L 18.83±5.74 ** 23.97±4.87 ** 29.76±5.33 **1.25 μmol/L 26.73±3.88 ** 36.26±3.90 ** 38.59±4.02 **2.5 μmol/L 34.65±4.62 ** 53.23±4.36 ** 66.92±3.96 **5 μmol/L 62.51±5.57 ** 76.68±7.27 ** 86.72±9.37 **10 μmol/L 82.64±8.56 ** 88.67±7.78 ** 89.56±8.39 **P值 <0.01 <0.01 <0.01

2.3 五味子乙素對細胞凋亡的影響：與空白對照組相比，不同濃度的五味子乙素處理牙髓細胞后，各藥物組細胞的總凋亡率明顯下降（P<0.01），且與藥物濃度呈現一定的依賴性，差異具有統計學意義。

2.4 五味子乙素對牙髓細胞中ALP、DSPP、HtrA1、TGF-β1mRNA相對表達量的影響：不同濃度五味子乙素處理牙髓細胞后，藥物組細胞中的ALP、DSPP、TGF-β1mRNA相對表達量均高于空白對照組（P<0.05和P<0.01），且與藥物濃度呈現一定的依賴性，差異具有統計學意義；HtrA1的mRNA相對表達量雖然也高于空白對照組，但是與五味子乙素的藥物濃度的優勢不顯著。

2.5 五味子乙素對牙髓細胞中FAK、ERK、AKT表達的影響：Wstern blot結果顯示，不同濃度五味子乙素處理牙髓細胞后，藥物組細胞中的FAK、ERK、AKT的表達顯著高于空白對照組（P<0.05和P<0.01），且與藥物濃度呈現一定的依賴性，差異具有統計學意義。

3 討 論

研究發現，五味子乙素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等的作用，能夠抑制癌細胞增殖和轉移、抑制神經細胞凋亡，改善阿爾茨海默癥小鼠的學習記憶能力、還可以抑制腎小管上皮細胞凋亡[4-5]。但是五味子乙素對缺血誘導的人牙髓細胞的增殖、凋亡等的影響以及其可能的作用機制研究報道較少。本研究通過FAK/ERK/AKT信號通路探討五味子乙素對缺血誘導人牙髓細胞的影響及作用機制，研究結果發現，不同濃度五味子乙素處理牙髓細胞后，隨著五味子乙素濃度的增加牙髓細胞的增殖率呈現上升趨勢，而牙髓細胞凋亡率明顯下降，藥物組細胞中的FAK、ERK、AKT的表達顯著高于空白對照組，且與藥物濃度呈現一定的依賴性。

細胞的增殖和凋亡一直是一種平衡狀態存在于機體內，這種平衡一旦被打破就會引起一些病變的發生。細胞內的基因與細胞凋亡的發生發展有著直接的關系，然而細胞外的因素主要是可以通過一些信號傳導因子作用于細胞內的金銀，從而間接地影響了細胞的凋亡和增殖，許多信號通路參與了牙髓細胞的發生發展過程[6]。FAK作為一種蛋白質底物，是細胞增殖、遷移和凋亡的主要信號介質，研究發現，FAK對人牙髓細胞的細胞骨架組織有一定的影響[7-8]，因此，五味子乙素可能通過激活FAK信號來調節細胞骨架元素的動態變形和細胞凋亡。AKT是FAK下游靶點，在五味子乙素的作用下，由于FAK信號被激活引起ERK/AKT等下游信號被轉導[9]]。在本研究結果發現五味子乙素可以使牙髓細胞中FAK、ERK、AKT的表達增強。