半乳糖凝集素- 1、 p16蛋白表達與宮頸癌患者臨床特征的關系

江娜，王秀虹

咸寧市中心醫院湖北科技學院附屬第一醫院婦科，湖北咸寧437100

宮頸癌是常見的一種婦科惡性腫瘤，其發病機制復雜[1-2]。有研究報道，p16是發現最早的可以直接參與細胞周期調控，調節細胞增殖分裂，是與細胞生長分化和惡性腫瘤細胞分裂密切相關的基因，其在多種惡性腫瘤中表達上調，且負責細胞增殖的負性調控，是細胞周期中重要的一種抑癌基因[3]。半乳糖凝集素（galectin，Gal）是人體組織細胞中富含的由1個或2個糖結構識別域組成的凝集素家族中的重要成員[4]，通過與β-半乳糖苷特異性結合可以介導細胞的黏附、增殖、凋亡和炎性反應。相關研究表明，Gal-1表達上調與惡性腫瘤細胞的侵襲性和淋巴結轉移密切相關[5-6]，但目前國內外關于p16、Gal-1的表達與宮頸癌關系的研究及報道仍較少，本研究觀察了宮頸癌組織中p16、Gal-1蛋白的表達情況，并對p16、Gal-1蛋白表達與宮頸癌患者臨床特征的關系進行探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2018年12月咸寧市中心醫院湖北科技學院附屬第一醫院收治的宮頸癌患者。納入標準：①符合《婦產科學》第8版中宮頸癌的標準[7]；②病理學結果證實為宮頸癌；③年齡19～65歲；④既往未接受抗腫瘤放化療或免疫性治療；⑤病歷資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②伴有免疫系統疾病或其他類型的宮頸疾病。根據納入和排除標準，本研究共納入宮頸癌患者100例，并收集患者的宮頸癌組織標本。另外，選取同期于咸寧市中心醫院湖北科技學院附屬第一醫院接受治療的100例宮頸上皮瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者的CIN組織為對照。100例宮頸癌患者的年齡為36～65歲，平均（48.9±8.5）歲；國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期標準：I期22例，Ⅱ期28例，Ⅲ期37例，Ⅳ期13例；有淋巴結轉移64例，無淋巴結轉移36例；腫瘤分化程度：低分化53例，中分化27例，高分化20例；病理學類型：鱗癌61例，腺癌39例。100例CIN患者的年齡為34～65歲，平均（48.0±11.0）歲；CINI級27例，CINⅡ級46例，CIN Ⅲ級27例。

1.2 免疫組織化學染色

取宮頸癌組織和CIN組織，行二甲苯透明石蠟切片，浸泡2次；依次用100%、95%、75%、50%的乙醇梯度復水，各浸泡2 min后自來水沖洗。檸檬酸高壓1.5 min修復組織抗原；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次3～5 min；除去PBS，向每張切片中加50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS；每張切片加入50 μl第一抗體的切片，室溫條件下孵育60 min；PBS沖洗3次，每次3～5 min；除去PBS，接著用50 μl即用型MaxVision試劑，室溫條件下孵育15 min；PBS沖洗3次，每次3 min；除去PBS，加100 μl新配制的二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，5 min后顯微鏡下觀察；自來水沖洗后加蘇木素復染再用自來水沖洗返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后再中性樹膠封固；鏡下閱片、攝像；病理圖像分析儀計數、采圖。

1.3 免疫組織化學法評分標準

免疫組化染色的評分標準：Gal-1蛋白陽性表達為細胞質或細胞核中呈黃色、橙色、棕色甚至褐色染色；p16蛋白陽性表達為細胞質或細胞核中呈黃色、橙色、棕色甚至褐色染色。根據著色程度評分：0分，未染色；1分，僅呈淡黃色染色；2分，呈棕黃色染色；3分，呈褐色、黑色染色。根據陽性細胞所占比例評分：1分，陽性細胞所占比例≤10%；2分，陽性細胞所占比例為11%～50%；3分，陽性細胞所占比例為51%～75%；4分，陽性細胞所占比例＞75%。將染色程度與陽性細胞所占比例得分相乘，乘積＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中Gal- 1、 p16蛋白陽性表達率的比較

宮頸癌組織中Gal-1、p16蛋白的陽性表達率均明顯高于CIN組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中Gal- 1、 p16蛋白陽性表達情況的比較[ n（%）]

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中Gal- 1蛋白、 p16蛋白陽性表達率的比較

FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、腫瘤分化程度為低分化的宮頸癌患者宮頸癌組織中Gal-1蛋白陽性表達率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、腫瘤分化程度為中高分化的患者，差異均有統計學意義（χ2=6.417、4.382、6.483，P＜0.05）；腫瘤分化程度為低分化宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達率明顯高于腫瘤分化程度為中高分化的患者，差異有統計學意義（χ2=7.868，P＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中Gal- 1、 p16蛋白的陽性表達情況（ n=100）

3 討論

宮頸癌是目前對女性健康威脅最大的婦科惡性腫瘤，其病死率位于女性婦科惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌。宮頸癌發生發展的機制較為復雜，與細胞周期調節失控、抑癌基因表達和細胞凋亡等均有關[8]。

p16是與細胞周期密切相關的新的抗癌基因，定位于人類染色體9p21，由3個外顯子和2個內含子組成，3個外顯子分別為126、307、11 bp[9-10]。p16定位于細胞核中，作為細胞周期中的基本基因和細胞周期調控蛋白，其可以參與細胞增殖的負性調節過程，阻止細胞由G1期進入S期，進而抑制細胞增殖。相關研究表明，與p53基因相比，p16是參與細胞周期調控的更重要的一種抑癌基因，其可以參與肺癌、乳腺癌等多種腫瘤的直接形成[11]。p16基因是細胞周期中的剎車裝置，一旦失靈細胞就會出現無限增殖，是惡性腫瘤形成的主要原因。本研究結果顯示，宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達率明顯高于CIN組織（P＜0.01），表明p16基因直接參與宮頸癌的形成過程。相關研究顯示，宮頸癌患者的p16表達水平明顯高于健康女性[12-13]，與本研究結論一致。本研究結果還顯示，腫瘤分化程度為低分化宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達率明顯高于腫瘤分化程度為中高分化的患者（P＜0.01），提示p16表達上調與宮頸癌進展關系密切，可作為宮頸癌病情預測的重要指標。Gal-1蛋白是哺乳動物體內參與腫瘤發生發展的重要的半乳糖凝聚素家族成員，靶向分泌至細胞質和細胞核中，通過與細胞質或細胞核中蛋白相互作用，進行細胞信號轉導，同時可調控信使RNA（messenger RNA，mRNA）剪切過程進而影響細胞周期、細胞增殖和細胞凋亡。相關研究表明，Gal-1蛋白在膀胱癌等多種腫瘤組織中高表達[14]。還有研究報道，結腸腺癌的基質高表達Gal-1蛋白且與腫瘤的侵襲能力、惡性程度密切相關，Gal-1蛋白高表達提示惡性腫瘤的形成[15]。本研究結果顯示，宮頸癌組織中Gal-1蛋白的陽性表達率明顯高于CIN組織（P＜0.01），表明Gal-1蛋白可能參與宮頸癌的發生發展過程。本研究還發現，FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、腫瘤分化程度為低分化的宮頸癌患者宮頸癌組織中Gal-1蛋白的陽性表達率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、腫瘤分化程度為中高分化的患者（P＜0.05），表明Gal-1蛋白可能作為宮頸癌不良預后的評估指標。Gal-1蛋白參與宮頸癌侵襲、惡性轉移的機制較為復雜，其中主要有以下2個方面：①上調腫瘤微血管增殖，Gal-1蛋白主要通過與神經纖毛蛋白1（neuropilin-1，NRP1）受體相結合，介導內皮細胞的黏附遷移，同時還能促進血管內皮生長因子2（vascular endothelial growth factor 2，VEGF2）受體磷酸化，進而活化有絲分裂原激活蛋白應激活化蛋白激酶1（stress-activated protein kinase 1，SAPK）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑，促進腫瘤血管新生[16]。②增強腫瘤細胞的增殖、遷移能力，Gal-1蛋白可抑制RET、JAK2的表達，并促進腫瘤細胞增殖、遷移。

綜上所述，宮頸癌組織中Gal-1、p16蛋白表達明顯上調，并且與宮頸癌的惡性程度密切相關。Gal-1、p16蛋白在宮頸癌發生發展、組織分化程度等臨床不良預后方面的評估價值，對宮頸癌的診斷治療具有一定指導意義，可從分子水平推進臨床對宮頸癌發生發展機制的研究。