不同預處理對菜蕨孢子萌發(fā)的影響

楊曦　蘇翠　蒙真鋮　陳鴻潔

摘? ?要? ?通過對菜蕨孢子的收集時間、貯藏方式、貯藏時間、接種前預處理、消毒滅菌、接種裝置等組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)設置對比試驗，篩選出有利于提高孢子萌發(fā)率的預處理方式。結果表明：菜蕨孢子最佳收集期為7—9月;將收集到的孢子裝入離心管后置于4 ℃冰箱中貯藏，貯藏時間不超過1年的孢子都具有較高的活性;以4 ℃冰箱中貯藏3個月的孢子為外植體進行組織培養(yǎng)，用無菌水浸泡4 h，再用0.1%升汞消毒7 min，清洗3遍后接種于袋裝MS培養(yǎng)基中，菜蕨孢子萌發(fā)轉化為原葉體的數(shù)量最多。

關鍵詞? ? 菜蕨;孢子;原葉體;預處理;萌發(fā)

中圖分類號：Q943.1;S649? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.015

菜蕨[Callipteris esculenta （Retz.） J. Sm. ex Moore et Houlst]為蹄蓋蕨科（Athyriaceae）菜蕨屬（Callipteris）植物[1]，是滇東南地區(qū)深受群眾喜愛的食用蕨類之一。菜蕨在該地區(qū)食用歷史悠久，需求量大，但目前對食用蕨類資源的開發(fā)基本停留在采挖野生資源的原始模式，單純依靠菜蕨自然繁殖，其繁殖率低、生長周期長、種苗獲得率低，所得到的種苗不能滿足大規(guī)模人工種植的需求[2]。近幾年，雖然出現(xiàn)郭志友等對菜蕨進行組織培養(yǎng)與植株再生的研究報道，但是在用孢子為外植體進行誘導的過程中還是存在孢子萌發(fā)率極低的問題[3]。針對這一問題，本研究以菜蕨的成熟孢子為試驗對象，對孢子的貯藏時間、貯藏方式、接種前的預處理、消毒滅菌方式、接種裝置等因素開展比較試驗，篩選有利于提高孢子萌發(fā)率的方式，為加快食用蕨類植物規(guī)模化生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以成熟的菜蕨孢子或孢子囊為試驗材料。

1.2 試驗方法

試驗時間為2017年12月。

1.2.1 孢子收集、貯藏方式

收集菜蕨孢子時，應選用健壯、有成熟孢子囊群的菜蕨植株羽葉，及時將羽葉孢子或孢子囊刮下，放入50 mL直立離心管中，一種貯藏于4 ℃冰箱中;另一種在常溫下貯藏備用。將不同貯藏方式、不同貯藏時間的孢子（見表1），分別取0.02 g裝入備好的濾紙袋中編號，作為外植體進行常規(guī)消毒滅菌。常規(guī)消毒方法：0.1%升汞浸泡8 min→無菌水沖洗3次，接種到聚乙烯袋裝MS培養(yǎng)基上，光照強度為1 500 lx，每天光照10～12 h，培養(yǎng)溫度為（27±2）℃。重復3次，50 d后統(tǒng)計其成熟的原葉體數(shù)量。試驗數(shù)據用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 接種前預處理

選用在4 ℃冰箱中貯藏3個月、18個月的菜蕨孢子，每個處理分別量取0.02 g，放入準備好的濾紙袋中作為外植體進行浸液處理，具體處理方式見表2，經過常規(guī)消毒滅菌后接種于袋裝MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件及常規(guī)消毒方法同上。觀察記錄每個處理最早萌發(fā)出原葉體的時間，并記錄萌發(fā)情況。

1.2.3 孢子的消毒滅菌

選用在4 ℃冰箱貯藏3個月的菜蕨孢子，分別量取0.02 g放入準備好的濾紙袋中，用無菌水浸泡3 h后，進行消毒滅菌。消毒方法采用組織培養(yǎng)上常用的0.1%升汞溶液浸泡消毒，浸泡時間分別為：3 min、5 min、7 min、10 min、15 min，無菌水沖洗3次后，分別接種到袋裝MS培養(yǎng)基中。每個消毒處理接種15袋，重復3次，培養(yǎng)條件同上，15 d后統(tǒng)計不同消毒時間的污染率，50 d后觀察孢子萌發(fā)情況。

1.2.4 接種方式

隨著組織培養(yǎng)技術的發(fā)展，近幾年在組織培養(yǎng)中多采用成本低廉、密封程度更好、體積小的一次性聚乙烯袋子代替?zhèn)鹘y(tǒng)玻璃瓶作為分裝培養(yǎng)基的載體。試驗采用13 cm×14 cm的聚乙烯袋子與傳統(tǒng)玻璃瓶作對比，將4 ℃冰箱中貯藏3個月的菜蕨孢子，經4 h無菌水浸液處理、常規(guī)消毒滅菌后，分別接種到配方相同的MS袋裝培養(yǎng)基和傳統(tǒng)玻璃瓶容器MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，50 d后觀察孢子萌發(fā)情況。

2 結果與分析

2.1 貯藏方式及時間對菜蕨孢子萌發(fā)的影響

試驗結果如圖1所示，在4 ℃冰箱中貯藏的菜蕨孢子萌發(fā)為成熟原葉體的數(shù)量明顯高于常溫貯藏。貯藏時間在3個月內的菜蕨孢子，隨貯藏時間增加，萌發(fā)量有一定量的增加，成熟原葉體均值最高可達128個，但貯藏6個月后的孢子整體萌發(fā)量下降比較顯著，特別是貯藏12個月后的孢子萌發(fā)數(shù)大幅度下降，常溫貯藏1年的菜蕨孢子萌發(fā)量極低，貯藏2年以后的孢子基本失活。試驗地處于熱帶季風氣候區(qū)，試驗開展時間為12月，雖然正值冬季，但相對溫暖濕潤，部分菜蕨配子體還長有極少量成熟孢子囊的羽葉，編號S1與編號S2的采集時間為冬季，孢子質量不佳，編號S3的孢子采集于孢子體羽葉生長旺盛期，成熟孢子囊最多，質量也最好，萌發(fā)為成熟原葉體的數(shù)量也最多。因此，選擇每年7—9月為孢子收集最佳時間，將收集到的孢子置于4 ℃冰箱中貯藏有助于保持孢子活性，能有效提高孢子萌發(fā)為原葉體的數(shù)量，但貯藏時間不宜過長，貯存期超過24個月的孢子已基本失活。

2.2 消毒滅菌前預處理對菜蕨孢子萌發(fā)的影響

試驗結果表明，在菜蕨孢子進行消毒滅菌前，將在4 ℃冰箱中貯藏3個月的孢子用無菌水或30 mg·L-1 GA3溶液浸泡4 h，可以提早孢子萌發(fā)時間，提高孢子萌發(fā)為原葉體的數(shù)量，對孢子萌發(fā)有較好的促進作用（見表3）。考慮到無菌水的經濟成本更低、操作簡單、更易獲得等優(yōu)點，選用無菌水浸泡4 h為較佳的預處理方法。將在4 ℃冰箱貯藏18個月的孢子進行相同浸液處理，Y3、Y4與CK2相比，孢子萌發(fā)得到的原葉體數(shù)也有所提高，特別是Y4處理在提早萌發(fā)時間和提高萌發(fā)量上效果顯著，與翟國燕等[4]研究報道GA3對前一年的孢子萌發(fā)有促進作用的結果相一致。

2.3 不同消毒時間對菜蕨孢子萌發(fā)的影響

試驗結果表明（見表4），延長0.1%升汞消毒滅菌時間，有利于降低污染率，即消毒時間越久，污染率越低;當消毒時間達到15 min時，污染率最低，為2.23%。但消毒時間超過10 min時，孢子萌發(fā)為原葉體的數(shù)量就大幅度下降;當消毒時間達15 min時，消毒滅菌雖徹底，但對孢子的傷害也最明顯，即孢子無污染，也不萌發(fā)轉化為原葉體，基本失活。綜合污染率和萌發(fā)轉化為原葉體情況來看，菜蕨孢子的適宜消毒滅菌時間為7 min。

2.4 不同接種裝置對菜蕨孢子萌發(fā)的影響

由圖2可以看出，同一份孢子經浸液處理、消毒滅菌后分別接種到袋裝MS培養(yǎng)基和傳統(tǒng)瓶裝MS培養(yǎng)基中，在其配方、培養(yǎng)條件都相同的情況下，袋裝培養(yǎng)基中的孢子萌發(fā)更快，萌發(fā)轉化為原葉體的數(shù)量要遠遠高于瓶裝培養(yǎng)基。由于袋裝培養(yǎng)基密封性更好，能長期保持潮濕的小環(huán)境，且培養(yǎng)基表面呈不規(guī)則狀，與孢子的有效接觸面更大，比傳統(tǒng)瓶裝呈近平面的培養(yǎng)基更有利于菜蕨孢子吸脹及伸出假根，孢子壁開裂長出綠色細胞，再由綠色細胞分裂、分化形成肉眼可見的綠色心形狀的原葉體，符合陳維倫[5]等報道孢子在潮濕的環(huán)境中先吸脹，生出假根長出綠細胞，再發(fā)育轉化為綠色心形原葉體的萌發(fā)特性相一致。

3 小結與討論

郭志友等[6]對菜蕨配子體的發(fā)育特征進行研究，發(fā)現(xiàn)菜蕨孢子易失活與其生長在潮濕的河谷和沙灘等生境有關。要提高菜蕨孢子的萌發(fā)率，就要保證孢子盡量不失活。本研究通過對成熟菜蕨孢子的采集時間、貯藏方式、貯藏時間、接種前預處理、消毒滅菌、接種裝置等因素開展比較試驗，觀察記錄菜蕨孢子的萌發(fā)情況，篩選出適宜的菜蕨孢子貯藏、預處理、消毒、接種方式。生長在溫暖濕潤熱帶雨林地區(qū)的菜蕨，其孢子生長有明顯的季節(jié)性，孢子最佳收集期為7—9月;將收集到的孢子裝入離心管后置于4 ℃冰箱中貯藏，比常溫貯藏更有利于孢子活性的保持，能有效增加孢子萌發(fā)轉化為原葉體的數(shù)量，但貯藏時間不宜過長，不能超過1年;在選用4 ℃冰箱貯藏的孢子為外植體的組織培養(yǎng)過程中，用無菌水浸泡4 h，再用0.1%升汞消毒7 min，清洗3遍后接種于袋裝MS培養(yǎng)基中，是促進菜蕨孢子萌發(fā)轉化為原葉體的最佳方法，對發(fā)展菜蕨規(guī)模化生產具有現(xiàn)實意義，但成熟原葉體轉化生長為孢子體方面還需進一步研究。

參考文獻：

[1] 中國科學院植物志編委會.中國植物志（卷3，第2分冊）[M].北京：科學出版社，1999：475-479.

[2] 楊曦，蘇翠，孔得信，等.河口地區(qū)蕨菜產業(yè)發(fā)展思考[J].南方農業(yè)，2017（5）：40-43.

[3] 郭治友，俞筱押，羅應，等.菜蕨的組織培養(yǎng)與植株再生[J].植物生理學通訊，2010（1）：59-60.

[4] 翟國燕，邊珂，賈克功，等.GA3及不同比例MS培養(yǎng)基對蕨菜孢子萌發(fā)的影響[J].中國蔬菜，2007（8）：21-23.

[5] 陳維倫，郭東紅，石雷，等.蕨類植物的離體種質保存[A].紀念秦仁昌論文集[C].北京：中國林業(yè)出版社，1999：412-416.

[6] 郭志友，趙德剛.菜蕨配子體的形態(tài)特征研究[J].貴州農業(yè)科學，2012，40（10）：29-32.

（責任編輯：易? 婧）