Drp1和自噬在七氟醚后處理大鼠心肌保護中的作用

王一珍，賀建東2，韓沖芳2，郭大鵬，王志豪

作為一種使用安全、有效性穩定的吸入性麻醉劑，七氟醚自誕生以來逐漸成為日常麻醉工作中重要的麻醉藥物[1]。研究證實七氟醚具有一定程度的心肌保護作用，而其中的作用機制尚未明確[2]。自噬是機體清除受損細胞器、維持內環境穩定的機制，大量研究已證實自噬參與心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia and reperfusion injury，MIRI)的各個階段[3]。動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是位于細胞質中介導細胞分裂的蛋白，被證實具有介導自噬并保護心肌的作用[4]。由此假設七氟醚對大鼠MIRI的保護作用與Drp1及自噬有關，本實驗擬通過建立大鼠MIRI模型，給予七氟醚后處理并測定相關心肌損傷指標及蛋白表達，探究Drp1和自噬在七氟醚后處理大鼠心肌保護中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 本實驗動物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，健康成年雄性SD大鼠45只，體重200～230 g，以隨機數字表法分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)和七氟醚后處理組(SpostC組)，各15只。所有實驗操作均已獲得山西醫科大學動物倫理委員會許可。

1.2 心肌缺血再灌注實驗模型制備 45只大鼠由20%烏拉坦以0.6 mL/100 g麻醉后固定于無菌保溫操作臺，四肢連接針狀電極，由BL NewCentury機能實驗系統記錄其心率(HR)、心電圖(ECG)。頸正中切口入路行氣管切開術，連接小型動物呼吸機(成都泰盟軟件有限公司，型號HX-101E)，調整呼吸參數為頻率60次/min，潮氣量2～3 mL/100 g，吸呼比1∶2，氧流量1 L/min，七氟醚揮發罐一端與氧氣管連接，一端與動物呼吸機連接，待生命體征穩定后開始實驗。采用文獻[5]方法制備大鼠MIRI模型，于大鼠胸骨左緣心尖搏動最強處剪開胸骨暴露心臟，以7-0帶針縫線沿左心耳下方找到冠狀動脈左前降支(LAD)穿過，穩定15 min后開始實驗。Sham組僅于LAD下穿線而不結扎，觀察150 min；I/R組在LAD下穿過縫線后，在縫線末端穿過聚乙烯導管，拉緊縫線結扎LAD，以結扎部位以下心肌發白，ECG示ST段抬高為缺血模型成功，30 min后松開扎線，以蒼白部位轉紅、ST段下移為再灌注成功，觀察120 min；SpostC組于再灌注前吸入2.5%七氟醚5 min后進行再灌注，觀察120 min。

1.3 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法測量心肌梗死面積 每組5只大鼠于再灌注結束后再次結扎冠狀動脈，于右頸內靜脈注入伊文氏藍染液1 mL，觀察大鼠口唇和四肢藍染2 min后取下心臟，洗凈血液，于-20 ℃短暫冰凍20 min后取出，垂直于心臟長軸將心臟均勻切成2 mm左右切片，經過TTC染色、固定后制成切片，圖像經掃描后由ImageJ軟件進行分析計算，藍色為非缺血區，紅色為缺血危險區，灰白色為壞死區。計算心肌梗死面積(infraction size，IS)值，IS=心肌梗死區占總截面百分比/危險區占總截面百分比。

1.4 Drp1及微血管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白表達測定(Western-blot法) 余10只大鼠于再灌注結束后迅速在冰上稱取心肌心尖部組織，以清潔剪刀將組織剪碎，并將其放入裂解液，經過裂解、離心后取上清液，按照BCA蛋白檢測試劑(Thermo Scientific，23225)說明進行蛋白質濃度檢測，計算上樣量，隨后進行蛋白電泳、轉模、孵育，后加入一抗Drp1多克隆抗體(1∶1 000，ABclonal，A2470)和LC3B-兔多克隆抗體(1∶1 000，proteintech，18725-1-AP)4 ℃孵育過夜、漂洗，后孵育HRP山羊抗兔二抗(1∶2 000，ABclonal，AS014)并漂洗。最后進行顯影、定影、成像。使用ImageJ量化圖像，并使用Photoshop處理圖像，得到經典WB條帶形式。

1.5 病理切片染色形態學觀察 取下蛋白檢測材料同時再取部分心尖部組織，用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)經過多聚甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片等一系列加工后將其制成切片，并將適量中性樹膠封固切片，標記后用光學顯微鏡觀察心肌細胞形態學，明確心肌細胞凋亡及損傷程度。

2 結 果

2.1 3組大鼠心肌梗死面積比較 與Sham組比較，I/R組和SpostC組大鼠心肌梗死面積均增大(P<0.01)；與I/R組比較，SpostC組大鼠心肌梗死面積減少(P<0.05)。詳見表1。

組別只數 IS值 Sham組50.1±0.5I/R組537.0±1.21)SpostC組526.3±2.61)2)

與Sham組比較，1)P<0.01；與I/R組比較，2)P<0.05

2.2 3組大鼠Drp1、LC3-Ⅱ蛋白表達水平比較 I/R組與SpostC組Drp1、LC3-Ⅱ表達水平較Sham組升高(P<0.05)；與I/R組比較，SpostC組Drp1、LC3-Ⅱ表達水平明顯下降(P<0.05)。詳見表2。

組別只數Drp1LC3-ⅡSham組 100.47±0.07 0.27±0.04 I/R組100.78±0.071)0.62±0.061)SpostC組 100.58±0.061)2)0.46±0.061)2)

與Sham組比較，1)P<0.05；與I/R組比較，2)P<0.05

2.3 心肌HE染色結果 光鏡下可見Sham組心肌細胞形態正常，心肌纖維排列整齊，染色較均勻，細胞核居中；I/R組心肌細胞形態改變，心肌纖維排列紊亂，可見部分纖維斷裂，細胞核破壞，可見較多炎性細胞，染色不均勻；與I/R組比較，SpostC組心肌細胞形態較正常，心肌纖維排列較整齊，可見細胞質輕度破壞，胞核相對完整，炎性細胞減少。詳見圖1。

圖1 3組大鼠心肌細胞HE染色結果(×400)

3 討 論

本實驗參照文獻[5]的方法，以結扎大鼠心肌冠狀動脈左前降支30 min，放松120 min的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型。研究結果顯示，I/R組在結扎后出現心電圖ST段抬高、結扎部位以下區域變白，并于松開扎線后ST段下移，蒼白區域變紅，120 min再灌注后心肌發生梗死，主要表現為IS值的增大及病理染色心肌細胞形態的變化，提示心肌缺血再灌注模型建立成功。

自噬主要由Beclin-1-Vps34和mTORC1兩條通路介導，整個自噬過程分為自噬發動、自噬小泡形成、自噬體膜延伸、自噬體融合和降解、自噬終止5個過程[6]。而LC3-Ⅰ位于細胞質中，在自噬發動后，在自噬相關蛋白7(Atg7)和自噬相關蛋白5(Atg5)的作用下形成LC3-Ⅱ，參與自噬體膜的融合延伸，LC3-Ⅱ的增加(或同時伴LC3-Ⅰ的減少)是自噬表達上調的典型標志[7]。Drp1作為代表細胞分裂的蛋白，同時被發現具有介導自噬的作用[4]。本研究發現，Sham組存在Drp1及LC3-Ⅱ蛋白低水平的表達，表明在正常心肌細胞代謝過程中存在一定程度的細胞分裂和自噬，其存在可能與維持細胞正常能量代謝有關[8]。

自噬在心肌缺血再灌注過程中的作用是一個變化的過程，在心肌缺血階段，一定程度的自噬可保護心肌免于缺氧損傷，而再灌注過程中，過度上調的自噬加速了心肌細胞的死亡[9-10]。本實驗發現I/R組心肌LC3-Ⅱ及Drp1表達均上調，心肌細胞IS值增大且病理染色出現損傷變化，表明再灌注期間Drp1及自噬表達上調，對心肌細胞造成損害。當給予七氟醚后處理后，Drp1及LC3-Ⅱ蛋白表達水平下降，提示心肌細胞分裂及自噬下調，且心肌細胞損傷程度減輕，表現在IS值下降及病理HE染色改變，提示七氟醚后處理能夠減輕MIRI，同時下調Drp1及LC3-Ⅱ的表達，減輕心肌細胞自噬，進一步提示Drp1及自噬在七氟醚后處理心肌保護中具有重要作用。

本實驗為在體實驗，無法排除在體神經、體液等復雜因素對實驗結果的影響，應進一步進行離體實驗進行探究；隨著對細胞分裂及自噬的進一步深入研究，應行細胞培養及相關基因敲除實驗，進一步探究七氟醚心肌保護的細胞機制，更加深入了解其相關信號蛋白轉導通路。