酶解法提取紫薯原花青素工藝優化

韓卓,李慧，馬龍

(蚌埠學院 食品與生物工程學院,安徽 蚌埠 233030)

紫薯，又叫黑薯、紫心甘薯等，于20世紀90年代從日本引進[1]，肉質呈紫色至深紫色。紫薯中含有的人體必需的賴氨酸和礦物質元素銅、錳、鋅等含量較普通的甘薯高3～8倍，而硒元素含量高達20倍左右[2]。除含有普通甘薯所含的多糖、氨基酸、維生素等營養成分外，還富含原花青素、黃酮等生物活性成分，營養價值遠高于普通甘薯，具有預防高血壓、減輕肝機能障礙、預防心血管疾病、清除人體自由基、抗癌等多種保健功能[3-8]。目前對于紫薯的利用仍以鮮食為主，對紫薯生物活性成分的研究和深加工報道并不多。

原花青素(proanthocyanidins，PC) 是一種有著特殊結構的生物類黃酮混合物，主要存在于偏紅色或紫色的植物中，是一種強效的天然自由基清除劑[9]，廣泛應用于食品、藥品、保健品等領域。作為食品調料，廣泛添加于飲料、酒等食品中，不僅具有防腐抑菌的功效，還可提升食品的營養保健功能[10]。目前市售的商品原花青素基本來源于葡萄籽提取物，而葡萄籽原花青素的穩定性相對較差。因此，本研究以紫薯塊根為原料，采用酶解法提取再經響應面法進行優化，期望對紫薯原花青素的開發利用提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯：市售，低溫烘干后粉碎備用。

無水乙醇(分析純)：安徽安特食品股份有限公司；檸檬酸、鹽酸(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉(分析純)：天津市永大化學試劑有限公司；正丁醇、甲醇(分析純)：天津市大茂化學試劑廠；硫酸鐵氨(分析純)：上海展云化工有限公司；原花青素標準品(HPLC≥95%)：上海金穗生物科技有限公司；纖維素酶(10000 U/g)：上海原生態生物科技有限公司；中性蛋白酶(100000 U/g)：上海凱爾生物科技有限公司；α-淀粉酶(40000 U/g)：索萊寶公司。

1.2 儀器與設備

722可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；XFB-200高速中藥粉碎機 吉首市中誠制藥機械廠；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FA-14電子天平 上海海康電子儀器廠；PHS-25型酸度計 上海宵盛儀器制造有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；H4-20KR離心機 湖南可成儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原花青素標準曲線的制作[11]

配制0.2 mg/mL的原花青素標準溶液，吸取0，2，4，6，8，10 mL分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋成濃度分別為0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mg/mL。吸取每個容量瓶中的溶液1～10 mL具塞試管中加入0.2 mL的2%硫酸鐵氨溶液、6 mL的鹽酸-正丁醇溶液，搖勻，放置沸水中水浴30 min，取出放入冷水中冷卻10 min。然后用紫外分光光度計在546 nm處測其吸光度，以原花青素質量濃度(x)為橫坐標，對應檢測的吸光度值(y)為縱坐標，繪制原花青素標準曲線。

1.3.2 原花青素的提取工藝流程

新鮮的紫薯清洗切片，烘干粉碎過篩，準確稱量1 g紫薯粉于錐形瓶中，加入一定體積純水，加入一定量的酶，加檸檬酸調節pH后，置于超聲波清洗機中提取功率400 W、一定溫度下酶解提取一定時間，提取液4000 r/min離心15 min，濾液經旋轉蒸發儀低溫減壓濃縮[12]，用甲醇定容至25 mL，即得到樣品提取液。

根據原花青素標準曲線回歸方程計算出樣品提取液中的原花青素濃度，計算原花青素的提取率，計算公式如下：

式中：C為紫薯花青素質量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；M為樣品質量，g；P為原花青素提取率。

1.3.3 單因素試驗

分別考察不同酶種類(纖維素酶、α-淀粉酶、中性蛋白酶)及濃度(50，100，150，200，250 μg/mL)、酶解溫度(25，35，45，55，65 ℃)、酶解時間(20，35，50，65，80 min)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、pH(4，5，6，7，8)對紫薯中原花青素提取率的影響。

在單因素試驗結果分析基礎上，基于Box-Behnken設計的響應曲面法對紫薯中原花青素提取工藝進行優化，選取3個因子pH(C)、酶解時間(A)、酶解溫度(B)為自變量，以原花青素提取率(Y)為響應面值，并以1，0，-1分別代表自變量的高、中、低水平，響應面試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面因子與水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結果與分析

2.1 原花青素標準曲線的繪制

以原花青素質量濃度(x)為橫坐標，對應檢測的吸光度值(y)為縱坐標，繪制原花青素標準曲線，結果見圖1。

圖1 原花青素含量標準曲線Fig.1 Standard curve of procyanidians content

由圖1可知，原花青素標準曲線回歸方程為y=3.4196x-0.0005，相關系數R2=0.9996，表明原花青素質量濃度在0～0.04 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 不同酶類及用量對提取率的影響

不同酶類及用量對提取率的影響結果見圖2。

圖2 不同酶類及用量對提取率的影響Fig.2 Effect of different enzyme types and dosage on extraction rate

由圖2可知，3種酶類對紫薯原花青素提取率r 影響為纖維素酶>α-淀粉酶>中性蛋白酶，中性蛋白酶對原花青素提取率的影響最小，這與紫薯所含蛋白質成分較少有關，纖維素酶對原花青素提取率的影響最大，這是因為纖維素酶能夠酶解植物細胞壁，有利于細胞內容物的溶出。隨著纖維素酶濃度的增加，原花青素提取率也逐漸增大，當纖維素酶添加量達到150 μg/mL時，提取率達到5.025%，加酶量繼續增加時原花青素提取率呈現下降趨勢，表明紫薯細胞壁中纖維素酶酶解完全，過多的酶量反而會影響原花青素的溶出，故選擇纖維素酶濃度為150 μg/mL做進一步優化。

2.2.2 酶解溫度對提取率的影響

酶解溫度對提取率的影響結果見圖3。

圖3 酶解溫度對提取率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate

由圖3可知，酶解溫度在30～40 ℃范圍時，紫薯原花青素提取率隨溫度升高而呈上升趨勢，當酶解溫度達40 ℃時，提取率為5.035%；溫度繼續升高時提取率呈現下降趨勢，可能是由于溫度過高會影響酶的活性，此外原花青素熱穩定性較差，導致提取率下降，故選擇40 ℃做進一步優化。

2.2.3 酶解時間對提取率的影響

酶解時間對提取率的影響結果見圖4。

圖4 酶解時間對提取率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction rate

由圖4可知，酶解時間在20～65 min范圍時，紫薯原花青素提取率隨時間延長而呈上升趨勢，當酶解時間達65 min時，提取率為5.027%；隨著時間繼續增加，提取率趨于穩定，說明紫薯細胞壁基本酶解完全，原花青素有效溶出，故選擇65 min做進一步優化。

2.2.4 料液比對提取率的影響

料液比對提取率的影響結果見圖5。

圖5 料液比對提取率的影響Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on extraction rate

由圖5可知，料液比在1∶10～1∶30范圍時，紫薯原花青素提取率隨料液比增加而升高，當料液比達到1∶30時，提取率達5.019%；隨著料液比的增加，提取率呈現下降趨勢，可能是因為當提取劑量過多時，反而會影響酶的催化作用，故選擇1∶30做進一步優化。

2.2.5 pH對提取率的影響

pH對提取率的影響結果見圖6。

圖6 pH對提取率的影響Fig.6 Effect of pH on extraction rate

由圖6可知，pH在4～6范圍時，紫薯原花青素隨著pH增加而升高，當pH為6時，提取率達5.031%；隨著pH增加，提取率呈現下降趨勢，可能是因為過高的pH影響了纖維素酶的活性，使得細胞壁酶解不完全，導致提取率下降，故選擇pH為6做進一步優化。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計因素水平和結果

響應面試驗設計因素水平和結果見表2。

表2 響應面試驗設計因素水平及結果Table 2 Factors and levels and results of response surface experimental design

續 表

通過Design-Expert 10.0.7軟件對表2數據進行二次多項式擬合，得到原花青素提取率與酶解時間(A)、酶解溫度(B)、pH(C)的二次多項回歸方程：

Y=-4.45134+0.041727A+0.17658B+1.36348C+4.05000E-004AB-8.66667E-004AC-7.12500E-003BC-4.08667E-004A2-1.82200E-003B2-0.079450C2。

2.3.2 模型建立與方差分析

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注： “*”表示對結果影響顯著(P<0.05)；“**”表示對結果影響極顯著(P<0.0001)。

表3回歸模型和方差分析結果顯示，因素A、B、C、AB、BC、A2、C2對紫薯原花青素提取率的影響達到顯著水平(P<0.005)，因素B2對紫薯原花青素提取率的影響極顯著(P<0.0001)。模型F值為54.20，P<0.0001，失擬項P值為0.0867>0.05，表明該模型顯著性極高，失擬項不顯著，說明預估值和實測值之間擬合度較好。模型的相關系數R2=0.9857、校正確定系數RAdj2=0.9677，表明該模型能夠解釋96.77%響應值的變化，因此該模型可用于對紫薯原花青素提取率的分析和預測。根據F值大小判定，3個因素對響應值影響的順序為B(酶解溫度)>C(pH)>A(酶解時間)。

2.3.3 響應面分析與優化

根據上述回歸方程繪制響應面及等高線圖，分析酶解溫度、酶解時間和pH 3個因素對紫薯原花青素提取率的影響，響應面及等高線見圖7。

圖7 酶解溫度、酶解時間和pH交互作用對提取率影響的響應曲面圖Fig.7 Response surface plots of the effects of interaction between enzymatic hydrolysis temperature, enzymatic hydrolysis time and pH on extraction rate of proanthocyanidins

由圖7可知，酶解溫度和pH對應的響應曲面陡峭，說明兩者交互作用較強；酶解時間和pH對應的響應曲面較為平緩，說明這兩因素交互作用較弱，這與表3顯著性分析結果一致。在酶解溫度和pH對應等高線圖中，等高線沿酶解溫度降低方向密集，增高方向稀疏，說明降低溫度會顯著影響紫薯原花青素的提取率。

2.3.4 驗證試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用響應面軟件Design-Expert 10.0.7進行優化，最佳提取工藝條件為酶解時間65.957 min、酶解溫度43.538 ℃、pH 6.269。根據實際操作情況做相應調整，確定最佳提取工藝條件為：酶解時間65 min、酶解溫度43 ℃、pH 6.2，在此條件下進行驗證，實際提取率為5.039%，與預測值接近，說明該模型建立可靠，可用于對紫薯原花青素提取條件的優化。

3 結論

本研究采用酶解法提取紫薯原花青素，纖維素酶的加入有利于紫薯細胞壁的破碎，促進胞內原花青素的溶出。在單因素試驗結果基礎上，通過Box-Behnken中心試驗設計原理，以提取率為響應值，建立紫薯原花青素提取率的二次回歸模型，確定最佳工藝條件為酶解時間65 min、酶解溫度43 ℃、pH 6.2，在此條件下進行驗證測得原花青素提取率為5.039%，與預測值接近，說明采用此工藝條件參數可靠，適合于提取紫薯中原花青素的工業化生產。