酸木瓜總黃酮提取工藝的優化

常婭妮，王亞嵐，李玲

（天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384）

酸木瓜（Chaenomeles sinensis）是一種古老的水果樹上結出的果子，屬于被子植物門雙子葉植物綱薔薇科木瓜屬，也被稱作木梨或者光皮木瓜，是云南特產，特別是在大理栽植廣泛，是集藥用、食用和觀賞為一體的果實，有一種特殊的香味，色澤金黃，營養極其豐富。酸木瓜中的主要元素都是有益于人體的，如酸木瓜中特有的木瓜蛋白酶，它能將脂肪轉化為脂肪酸，可以促進脂肪的消化和吸收，也可以幫助脾臟消化，酸木瓜中特有的木瓜生物堿也具有抗菌和抵制腫瘤的作用[1]。酸木瓜中還含有具有保護肝臟、抵抗炎癥、抑制細菌、降低血脂、預防肝硬化、抗衰老、軟化血管等功能[2]的齊墩果酸。酸木瓜還可以制作成為果酒、泡酒[3-4]、果脯[5]、木瓜牛奶、木瓜飲料[6-7]等，同時也能用來制作美味佳肴，在大理地區用酸木瓜做成的酸木瓜雞、酸木瓜魚等，滋味非常可口。酸木瓜也是一種可以健脾、開胃、舒通筋骨、祛風寒除濕氣、減輕疼痛，醫治和防止風濕病和缺乏維生素C癥的藥物。黃酮類物質廣泛的存在于生物體中，它擁有較強的生物活性和藥物活性，許多研究表明，酸木瓜中的黃酮類物質具有較強的抗氧化作用和增強血管彈性、降血壓、預防心律失常等效用[8]。近年來隨著人們生活水平的提高，飲食健康問題日益被大家看重，尤其富含各種抗氧化成分的食物更是備受青睞，它們的保健藥用價值與其所含的抗氧化成分關系密不可分，所以以天然食材為原料開發各種食品級抗氧化劑等保健產品勢在必行[9-14]。

超聲波在液體中具有空化效應、機械效應和熱效應，這些效應可以加快植物中有效成分的溶出，從而加速植物活性組分的提取[15]，超聲波乙醇輔助法能夠更加高效、便捷和低污染的提取植物中的活性成分。目前利用超聲波從植物中提取精油[16]、皂素[17]、蛋白質[18]、黃酮類等活性物質的研究較多，但是以酸木瓜為原料利用超聲波提取黃酮類物質的研究較少，且沒有從酸木瓜果皮、果肉和籽中分別提取黃酮類物質的研究。因而本文分別以酸木瓜的果皮、果肉、籽為原料，選取超聲波的超聲功率、提取時間、料液比和乙醇體積分數4個因素，考察酸木瓜不同部位的總黃酮含量差異情況，并選取總黃酮含量較多的部位進行正交試驗，得到在酸木瓜中提取總黃酮的最優工藝條件，為酸木瓜中黃酮類物質的高效提取和酸木瓜果皮、果肉和籽的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸木瓜：產自云南大理，選取大小適中的新鮮青果，果重約為250g/個，4℃冷藏備用；蘆丁標準品：北京百靈科技有限公司；95%乙醇、無水乙醇、NaOH、Al（NO3）3、NaNO2（分析純）：天津康科德有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-3200S紫外分光光度計：上海美普達儀器有限公司；SorvallTM ST16高速離心機：德國Thermo Fisher Scientific公司；JRA-650T超聲波提取機：無錫杰瑞安儀器設備有限公司；SHZ-DⅢ予華牌循環水真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；WF-B高速萬能粉碎機：科威機械（上海）有限公司；DHG-9145A電熱鼓風干燥箱、BPZ-6120-2B真空干燥箱：上海恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準品配制

參照了馬文兵等[19]的方法和2010年版《中華人民共和國藥典》[20]，精準稱取0.024 7 g蘆丁標準品，在105℃下利用真空干燥箱干燥4 h至重量穩定不變，再溶解于適量的70%乙醇中，為了使其充分溶解，可以轉至超聲波清洗器中適當超聲，待完全溶解后再轉至100 mL容量瓶中并定容至刻度，得到的標準品濃度為0.247（mg/mL）。

1.3.2 酸木瓜中總黃酮的提取工藝

酸木瓜樣品洗凈，切碎后，將新鮮的酸木瓜肉、皮、籽放在鼓風干燥箱內50℃下烘干至恒重，用高速粉碎機分別粉碎酸木瓜果肉、果皮、籽，60目過篩備用。精確稱取酸木瓜果皮、籽各1 g和酸木瓜果肉2 g放置于容量為50 mL的錐形瓶中，在不同條件下超聲取提，將獲得的提取物進行離心、降壓抽取過濾，收集濾液。為了充分提取酸木瓜的總黃酮成分，應重復操作兩次，合并濾液靜置后，取上清液備用，使用70%的乙醇溶液定容，即得到酸木瓜果皮、果肉和籽的樣液。

1.3.3 測定方法

利用黃酮類物質在Al（NO3）3與亞硝酸鹽的作用下產生絡合物，且在堿性環境中顯色的特性，采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法[21]，選擇吸收峰較大的510 nm處波長[22]，用蘆丁標準品配制標準曲線，酸木瓜樣液顯色完畢后，在510 nm波長下測其吸光度值，由標準曲線計算其總黃酮的質量濃度，并計算其總黃酮得率：

式中：C為酸木瓜提取液的濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為最初的定容容積，mL；m為酸木瓜的干粉質量，g。

重復操作3次取平均值。

1.3.4 單因素試驗的設計

影響超聲波乙醇輔助法提取酸木瓜中總黃酮的主要因素有乙醇體積分數、超聲時間、料液比、超聲功率等，因此，在固定超聲溫度60℃的條件下，以提取出的目標物得率為指標，分別對這4種影響因素進行單因素試驗，考察各因素及水平對酸木瓜果皮、果肉和籽的總黃酮得率的影響。

1.3.4.1 料液比對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率影響的設計

準確稱取處理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），分別按酸木瓜與乙醇溶液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入體積分數為 60%的乙醇溶液，在超聲功率198 W的條件下超聲30 min提取酸木瓜中的總黃酮，考察料液比對酸木瓜中總黃酮得率的影響。

1.3.4.2 乙醇體積分數對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率影響的設計

準確稱取處理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），按酸木瓜與乙醇溶液1∶25（g/mL）的比例分別加入體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在超聲功率198 W的條件下超聲30 min提取酸木瓜中的總黃酮，考察乙醇體積分數對酸木瓜中總黃酮得率的影響。

1.3.4.3 超聲波提取功率對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率影響的設計

準確稱取處理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），按酸木瓜與乙醇溶液1∶25（g/mL）的比例加入體積分數為60%的乙醇溶液，分別在超聲功率132、165、198、231、264 W 的條件下超聲 30 min 提取酸木瓜中的總黃酮，考察超聲功率對酸木瓜中總黃酮得率的影響。

1.3.4.4 超聲波提取時間對酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率影響的設計

準確稱取處理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），按酸木瓜與乙醇溶液1∶25（g/mL）的比例加入體積分數為60%的乙醇溶液，在超聲功率198 W的條件下分別超聲提取 10、20、30、40、50 min，考察超聲時間對酸木瓜中總黃酮得率的影響。

1.3.5 正交試驗設計

選擇總黃酮得率較高的酸木瓜部位，在單因素試驗的基礎上，篩選出各因素3個較好的水平，進行L9（34）正交試驗，進一步去考察這4個因素，以期得到最優的提取工藝條件，因素和水平見表1。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

在最大吸收波長510 nm下，確定以不同濃度蘆丁標準品的吸光度值A510為縱坐標，以蘆丁標準品濃度x（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為A=10.509x+0.011 1（R2=0.999 3），見圖 1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 料液比對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響

料液比對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 料液比對酸木瓜中總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid liquid ratio on total flavonoids yield in sour papaya

由圖2可以看出總黃酮得率在酸木瓜與乙醇溶液混合比為 1 ∶10（g/mL）～1 ∶25（g/mL）時，隨著乙醇溶液所占比例的的增大總黃酮得率也增加，當酸木瓜與乙醇溶液的比例增至1∶25（g/mL）時，總黃酮得率達到最高，此時酸木瓜果皮中總黃酮得率為6.42%，果肉中總黃酮得率為4.71%，籽中總黃酮得率為2.87%，當乙醇溶液所占的比例繼續增大時總黃酮得率均下降。田勇等[23]從昆侖胎菊中提取黃酮類物質時也遇到類似的情況，這可能是因為隨著乙醇添加量的增加，很多其它可以溶于乙醇的物質大部分溶出，阻礙了酸木瓜中總黃酮的溶出，而且溶劑使用量的適度增加有利于酸木瓜中總黃酮的溶解，但是溶劑使用量過大會不利于后期提取液的降壓抽濾提純[24]，從而導致酸木瓜中總黃酮得率降低，因此提取酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮的最佳料液比是1∶25（g/mL）。

2.3 乙醇的體積分數對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響

乙醇的體積分數對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對酸木瓜中總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of alcohol volume fraction on total flavonoids yield in sour papaya

隨著乙醇體積分數的逐漸增加，酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率也逐漸增加。如圖3所示，當乙醇體積分數為60%時，酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率均達到最大，此時果皮中總黃酮得率為7.03%，果肉中總黃酮得率為5.16%，籽中總黃酮得率為3.49%，而當乙醇的體積分數超過60%時，酸木瓜中的總黃酮得率均下降。這一方面是由于黃酮類物質是極性化合物，當乙醇溶液濃度較小時，極性較大，這樣黃酮類物質就會較易溶于乙醇溶劑里，而當乙醇體積分數過大時，其極性減弱，從而與黃酮類物質的極性相近程度降低，因此減少了酸木瓜中總黃酮的溶出[25]。另一方面是因為隨著乙醇體積分數的增加，酸木瓜中一些易溶于乙醇的脂溶性物質、糖類物質、色素等副產物流出，這些副產物會與提取液體系合并，阻礙黃酮類化合物從酸木瓜中溶出，使得總黃酮得率下降，在一些報道中從其他原材料中提取黃酮類物質也有同類現象[26]，因此提取酸木瓜中總黃酮的最佳乙醇體積分數是60%。

2.4 超聲波的提取功率對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響

超聲波的提取功率對酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對酸木瓜中總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield in sour papaya

由圖4可知，酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮得率均隨著超聲波提取功率的增加呈先升后降的趨勢，這種趨勢在其他文獻中也均有出現[27]，當超聲功率為198 W時，酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率均達到最大，此時酸木瓜果皮中總黃酮得率為7.22%，酸木瓜果肉中總黃酮得率為6.07%，酸木瓜籽中總黃酮得率為3.93%，當超聲波提取功率超過198 W時，總黃酮得率均下降，這可能是由于隨著超聲波功率變大，超聲波的輻射壓強產生的擾動效應、破碎和混合攪拌作用、空化作用等多級效應變得更加強烈，從而分子的運動速度和頻率就會變得更快，溶劑的穿透能力變得更強，加強了黃酮類物質的溶出[28]，但是當超聲波提取功率達到一定范圍時，因為超聲波產生的能量較大，導致物料內部的組織結構崩潰，造成了超聲波的擾動、空化等效應變小[29]，因而隨著超聲波功率逐漸升高，酸木瓜中總黃酮的得率逐漸降低，所以超聲波提取功率198 W是提取酸木瓜中總黃酮的最佳提取功率。

2.5 超聲波提取時間對酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率的影響

超聲波提取時間對酸木瓜果皮、果肉和籽中總黃酮得率的影響見圖5。

圖5 超聲時間對酸木瓜中總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on total flavonoid yield in sour papaya

如圖5所示，在超聲提取時間達到30 min時，總黃酮得率達到最大，此時酸木瓜果皮、果肉、籽中的總黃酮得率分別為7.2%、3.64%、3.53%，當超聲時間繼續增大時，總黃酮得率均下降。這可能是由于超聲時間在10 min～30 min范圍內時，提取時間過短，黃酮類物質還沒有被全部提取出來，從而黃酮得率隨著提取時間的增加而上升，但是隨著提取時間的增加，酸木瓜中的總黃酮有一部分被分解或氧化，導致了目標產物總黃酮的得率降低[30]。除此之外長時間的超聲會使得總黃酮得率向極值靠近，同時也會使提取物中雜質的含量增加，目標物含量反而也會降低[31]，因此超聲波提取時間30 min是酸木瓜中總黃酮的最佳提取時間。

2.6 提取酸木瓜果皮中總黃酮的正交試驗結果分析

通過單因素試驗發現不同提取條件下酸木瓜果皮中的總黃酮得率均高于果肉和籽中的總黃酮得率，所以選擇酸木瓜果皮進行L9（34）正交試驗，目的是為了進一步去探究超聲時間、超聲功率、料液比和乙醇的體積分數對酸木瓜果皮中總黃酮得率的影響，確定最佳提取工藝條件，正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2可知影響酸木瓜果皮中總黃酮得率的因素順序為：超聲時間＞液料比＞超聲功率＞乙醇的體積分數，提取酸木瓜果皮中總黃酮的最優工藝組合為A2B2C3D1，即超聲時間為25 min，超聲功率為231 W，料液比為1∶25（g/mL），乙醇體積分數為60%。由表3可知超聲時間對酸木瓜果皮中總黃酮得率影響顯著。為了確保試驗的準確性，用正交試驗得到的最佳提取工藝條件進行5次驗證試驗，驗證試驗得到酸木瓜皮中總黃酮得率為（7.31±0.38）%，表明試驗結果重復性、穩定性均較好，因此該提取工藝條件合理。

3 結論

采用超聲波乙醇輔助法提取酸木瓜果皮、果肉和籽中的總黃酮，得到較好的提取效果，經過單因素試驗可知，酸木瓜果皮、果肉、籽的總黃酮得率依次為：酸木瓜果皮＞酸木瓜果肉＞酸木瓜籽，說明酸木瓜中的總黃酮主要存在于果皮部位，所以選擇酸木瓜果皮進行正交試驗。正交試驗結果表明不同提取因素對酸木瓜果皮中總黃酮得率的影響順序為：超聲時間＞液料比＞超聲功率＞乙醇體積分數，最優提取條件為：超聲時間25 min，超聲功率 231 W，料液比 1 ∶25（g/mL），乙醇的體積分數60%，在此提取條件下，酸木瓜果皮中的總黃酮得率可以達到（7.31±0.38）%。