多糖中糖醛酸含量測定方法的研究進展

李亞平，周鴻立，2，*

（1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022；2.吉林省農(nóng)業(yè)資源綜合開發(fā)與利用工程研究中心，吉林吉林132022）

糖醛酸[1]又名透明質(zhì)酸，它作為多糖分子中6位的羥甲基氧化成羧基的產(chǎn)物，是一種酸性的黏多糖。其中，某些多糖本身或具有糖醛酸結(jié)構(gòu)的多糖常表現(xiàn)出十分重要的生物活性，例如，免疫調(diào)節(jié)活性、抗病毒活性[2-3]，而這類具有特殊生理活性的多糖中糖醛酸含量一般較高。由于含有糖醛酸結(jié)構(gòu)的多糖一般存在于植物中，因此，對于從天然植物中提取的多糖，確定其分子結(jié)構(gòu)中是否含有糖醛酸殘基具有極其重要的意義，所以有必要對糖醛酸含量測定方法進行研究。

因為糖類物質(zhì)大都沒有紫外吸收，須將其衍生化后方可進行測定。但在實際工作中，特別是在測定天然多糖產(chǎn)物中糖醛酸含量時，發(fā)現(xiàn)測得的結(jié)果往往與實際情況有偏差，這是由于糖醛酸和中性單糖并不是獨立存在，它們可能存在于同一個糖鏈中，無法將它們分離。例如，很多多糖以酸性雜多糖的形式存在，這在測定糖醛酸含量時可能存在相互干擾的情況[4]。因此探索準確測定天然多糖化合物中糖醛酸含量的方法是十分有必要的。目前多糖中糖醛酸含量測定的方法有光譜法和色譜法。本文對目前的國內(nèi)外糖醛酸的含量測定方法進行了綜述，以期為糖醛酸的質(zhì)量控制提供參考。

1 糖醛酸含量的檢測方法

1.1 光譜法

1.1.1 咔唑-硫酸法

咔唑-硫酸法[5]是測定糖醛酸含量的方法之一，糖醛酸在濃硫酸的作用下水解成帶有-COOH的糠醛或糠醛衍生物，與咔唑試劑發(fā)生縮合反應(yīng)，生成紫紅色化合物，其呈色強度與糖醛酸含量成正比，可比色定量。采用咔唑-硫酸法測定糖醛酸含量見如表1所示。

表1 咔唑-硫酸法對不同原材料中糖醛酸含量的測定Table 1 Determination of uronic acid content in different raw materials by carbazole sulphuric acid method

如表1所示，測定不同原材料所用硫酸硼砂和咔唑溶液的量差別不大，測定波長范圍在523 nm～530 nm，但沸水浴和顯色放置時間相差較大，水浴時間和溫度決定著多糖的水解程度，不同的多糖的單糖組成不同，水解時間和溫度也會不一樣。足夠的顯色放置時間是為了讓水解產(chǎn)物與咔唑試劑充分地絡(luò)合顯色。咔唑-硫酸法操作簡單，但是中性糖的水解產(chǎn)物也會與咔唑試劑反應(yīng)，繼而產(chǎn)生在糖醛酸的測定波長處有吸收的有色物質(zhì)，且隨著中性糖濃度的增加，其吸光度也隨之增大，使測量值偏高，且不能測出單個糖醛酸的含量。為減少咔唑-硫酸法的測量誤差，林穎等[10]提出了改進方法，為排除中性糖的干擾或?qū)ζ錅y定結(jié)果進行校正，采用樣品的吸光度與中性糖吸光度之差，測定結(jié)果與不含中性糖的糖醛酸實際測得吸光度基本一致，為準確地提高糖醛酸含量測定方法提供了試驗依據(jù)。楊釗等[11]采用咔唑-硫酸法測定海藻酸鈉多糖中糖醛酸的含量，利用圓二色譜法測得甘露糖醛酸和古羅糖醛酸含量之比（M/G值），根據(jù)M/G值和糖醛酸的表觀吸收系數(shù)計算得出每一種糖醛酸的含量，即海藻酸鈉中甘露糖醛酸及古羅糖醛酸的含量，圓二色譜法既能對海藻酸鈉多糖中糖醛酸的測定結(jié)果進行校正，又可測定單個糖醛酸的含量。先采用咔唑-硫酸法測定總糖醛酸的含量，再通過圓二色譜法校正才能測出單個糖醛酸的含量，此方法雖然能夠測出不同種類糖醛酸的含量，但過程比較繁瑣，操作復雜。

1.1.2 間羥基聯(lián)苯法

糖醛酸與硫酸硼砂溶液在沸水浴中水解，水解產(chǎn)物將進一步和間羥基聯(lián)苯反應(yīng)，產(chǎn)生粉紅色衍生物，且具有紫外吸收，在一定范圍內(nèi)，該衍生物的紫外吸收與糖醛酸含量呈線性關(guān)系，可采用比色法測定糖醛酸的含量。采用間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量見表2。

如表2可知，不同種類的多糖沸水浴時間、間羥基聯(lián)苯的用量及顯色時間差別較大，但每種多糖糖醛酸的含量差別也較大，變化范圍為1.19%～67.09%。此方法雖然簡單，但中性糖對測定結(jié)果同樣有所干擾。許會生等[20]改良了間羥基聯(lián)苯法，通過制作葡萄糖標準曲線、葡萄糖醛酸標準曲線、葡萄糖醛酸的苯酚-硫酸法標準曲線（糖醛酸對中性糖的干擾曲線）、葡萄糖的間羥基聯(lián)苯法標準曲線（中性單糖對糖醛酸的干擾曲線），將4條曲線聯(lián)立，消除中性糖和糖醛酸的相互干擾，避免了誤差，測定結(jié)果比較準確。任珍蕓等[21]添加少量氨基磺酸鹽可消除中性糖水解時產(chǎn)生的咖啡色或者茶色現(xiàn)象即消除生成非特異的顯色物質(zhì)的干擾，可以明顯使糖醛酸檢測結(jié)果更接近于真實值。另外一個重要的干擾因素是葡萄糖及半乳糖的存在對測量結(jié)果影響較大，但是甘露糖、鼠李糖及巖藻糖對糖醛酸含量的測定結(jié)果無明顯的影響。

表2 間羥基聯(lián)苯法對不同原材料中糖醛酸含量的測定Table 2 Determination of uronic acid content in different raw materials by hydroxy biphenyl method

與咔唑-硫酸法相比，中性糖對間羥基聯(lián)苯法的測定結(jié)果影響較小[22]，但改良后的間羥基聯(lián)苯能夠明顯消除中性糖的干擾。此法簡單易行，對糖醛酸的特異性比較強，很多天然產(chǎn)物中糖醛酸的質(zhì)量控制采用此分析方法，但該方法只能測定總糖醛酸的含量。

1.1.3 3，5-二甲基苯酚法

3，5-二甲苯酚法是糖醛酸在硫酸中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物5-甲酰基-2-呋喃甲酸能夠和3，5-二甲苯酚顯色，在450 nm處有最大吸光度，可采用分光光度法測定[23]。

劉俠等[24]采用此法測定的市售蜂蜜中果膠的含量，用半乳糖醛酸作為標準品，分別加入濃硫酸、NaCl溶液、3，5-二甲苯酚顯色，但中性單糖對此方法測定結(jié)果存在一定的干擾。Vineet Kumar等[25]和馬云翔等[26]利用400 nm和450 nm雙波長吸光度計算法消除中性糖對測定糖醛酸的干擾。在測定過程中，中性糖雖然在450 nm也有一定的吸收干擾，但其最大吸收波長為400 nm，因此采用450 nm和400 nm的吸光度差，可消除的背景干擾。3，5-二甲苯酚法測定糖醛酸含量時，改良后的方法能夠減少中性糖的干擾，靈敏度高，顯色穩(wěn)定，精密度較好，線性關(guān)系良好。

1.2 色譜法

1.2.1 氣相色譜法

氣相色譜（gas chromatography，GC）以其較強的分辨率、快速的分析效率以及可用于定性及定量分析等優(yōu)點，成為多糖結(jié)構(gòu)分析中最重要的手段之一。氣相色譜能夠測定不同多糖中的單糖含量，測定結(jié)構(gòu)準確度高[27]，但是對于糖醛酸等糖類的分析仍然存在一定難度，因為中性多糖和糖醛酸相鄰單位的糖苷鍵很難被酸水解，而且糖醛酸一旦被釋放出來，容易發(fā)生內(nèi)酯化，且內(nèi)酯化程度難以重復[28]。所以氣相色譜法對多糖樣品的要求很高，需要將多糖水解成單糖，并進行衍生化，將樣品最大程度地轉(zhuǎn)變成具有強揮發(fā)性的物質(zhì)。常用的衍生化方法有硅烷化和乙?；偨Y(jié)如表3，所用的檢測器為氫離子火焰檢測器、毛細管柱。

表3 氣相色譜法測定不同原材料中糖醛酸含量的條件對比Table 3 Comparison of conditions for determination of uronic acid content in different raw materials by gas chromatography

由表3可以看出，將多糖轉(zhuǎn)變成單糖的方式有酸水解和醇解，與其它3個GC的測定方法相比，豆腐渣和雞腿菇多糖[29]采用的是甘露醇進行甲醇解，硅烷化的方式進行衍生化。與酸水解相比，甲醇解能夠非常有效地切斷糖苷鍵，并且對單糖的破壞很小，還能夠?qū)⑻侨┧岬聂然D(zhuǎn)化為相應(yīng)的甲酯，因而大大地提高了揮發(fā)性，有利于樣品的檢測。蘋果果渣多糖[30]與另外兩個原材料的酸水解相比，在水解之后用Na2CO3溶液將內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為尿酸鈉，能夠在短時間內(nèi)將內(nèi)酯完全水解，既能縮短時間，又能使多糖完全水解，此法避免了多糖水解之后，部分糖醛酸以內(nèi)脂形式存在而不能被衍生化造成的誤差。新型細菌多糖[31]的糖醛酸衍生化方法避免使用對水分十分敏感的硅醚化試劑，衍生化非常有效，得到的測定結(jié)果準確。甜菜干粕多糖[32]采用全乙酰化法進行衍生化，相比于硅烷化，乙?；瓤梢员苊夤柰榛瘯r異構(gòu)體的產(chǎn)生，又能夠避免乙酰化時只能測定中性糖不能測定糖醛酸的缺點，并且可以同時測定其相對含量。

氣相色譜法測定糖醛酸的含量，不同的樣品水解和衍生化的條件不盡相同，需要優(yōu)化。對衍生化后的糖類具有良好的選擇性，樣品用量少，靈敏度較高，分析速度快，能同時測定多種糖醛酸的含量，具有很好的應(yīng)用前景。

1.2.2 液相色譜法

1.2.2.1 分子體積排阻液相色譜法

分子體積排阻液相色譜法是根據(jù)待測組分的分子體積大小來分離的，先將多糖水解，然后用葡聚糖凝膠色譜柱將糖醛酸分離出來并測定。糖醛酸是組成多糖的單糖之一，可以通過此法將糖醛酸與中性單糖分離。

Hirotaka Kakita等[33]采用正相分配色譜探究了微量分析糖醛酸的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)，色譜柱TSKgel Amide-80，將乙腈和磷酸二氫鉀鹽溶液流動相和柱后熒光衍生化結(jié)合起來，用紫外檢測器測定糖醛酸含量。在無鹽的有機流動相（例如乙腈和水）中，由于糖醛酸中的帶負電的羧基與二氧化硅基質(zhì)上的硅烷醇基之間的排斥，未被TSK凝膠Amide-80柱與無鹽有機流動相吸附，但添加鹽水增加了糖醛酸保留時間，但此方法中熒光衍生化時間較短，會使測定結(jié)果產(chǎn)生誤差。且糖類物質(zhì)沒有紫外吸收，所以需將水解之后的多糖進行衍生化才能用紫外檢測器檢測。申明月等[34]采用高效液相色譜法測定茶葉多糖中糖醛酸的含量，色譜柱為Sugar-PakⅠ，流動相為乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的水溶液，檢測器為示差檢測器。示差檢測器不需要衍生化，水解之后就能測定，操作簡單，且穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好，對糖類有良好的選擇性，適合于多糖中糖醛酸含量的測定。但分子體積排阻液相色譜法也有一定的缺點，有的單糖是異構(gòu)體，分子量相似，會導致其分離度不好，分離時間較長。

1.2.2.2 高效陰離子液相色譜法

高效陰離子色譜法能夠使單糖和寡糖在高pH值（pH＞12）的洗脫液中被解離成陰離子，并在陰離子柱上進行交換分配，從而達到快速、高效地分離，是分析多糖及低聚糖中單糖組成的有效手段，見表4。

由表4可知，3種多糖中糖醛酸的含量所用的流動相的配比和流速有所不同，目的是將糖醛酸更好地分離出來。此方法是利用單糖所帶的電荷數(shù)的差異，從而達到將其分離的目的，因此糖醛酸的峰遠離中性單糖的峰（中性單糖tR＜12 min），能有效的將糖醛酸與中性糖分離，大大提高糖醛酸含量測定結(jié)果的準確性，并且樣品不需要衍生化處理，操作簡單。采用脈沖-安培檢測器（pulse-ampere detector，PAD），能夠使其分辨率、選擇性和靈敏度大大提高，因此與其它方法相比更具優(yōu)越性，是測定糖醛酸含量的有效方法。

表4 高效陰離子色譜法測定不同原材料中糖醛酸含量的條件對比Table 4 Comparison of conditions for determination of uronic acid content in different raw materials by high performance anion liquid chromatography

2 結(jié)論

硫酸-咔唑法的咔唑試劑與中性糖反應(yīng)，使測定結(jié)果存在誤差；中性糖對間羥基聯(lián)苯法的干擾較小，但不能確定糖醛酸的種類；3，5-二甲基苯酚法操作簡單，雙波長計算法能夠排除中性糖的干擾，但3種光譜法只能測定總糖醛酸的含量。氣相色譜法樣品用量少，特別是對于單糖組成比較復雜的多糖和寡糖樣品，但需要衍生化。分子體積排阻液相色譜的分離時間較長，而陰離子液相色譜能夠很好的將中性單糖和糖醛酸分離，提高測定結(jié)果的準確性，且分離速度快，不需要衍生化，所以與其他方法相比，更具有優(yōu)越性。色譜法操作方便，分辨度高，選擇性好，靈敏度大，可同時測定多個組分，對儀器的要求較高。綜上所述，幾種糖醛酸含量測定方法各有優(yōu)缺點，但隨著檢測條件和儀器精密度的提高，糖醛酸的種類和含量都會很容易的檢測出來，不同的糖醛酸之間或者是和其它中性糖能夠很好分離開，排除中性糖的干擾，糖醛酸的質(zhì)量控制也會隨之提升。